基因组与群体进化，解析物种进化历程-05

案例八

研究背景

    穿山甲(pangolin)是鳞甲目穿山甲科物种的统称。由于穿山甲肉常被作为奢侈消费品，穿山甲甲片长期作为传统中药材等原因，使穿山甲成为“世界上偷猎和贩卖最严重的哺乳动物”，其非法贸易占野生动物非法跨国贸易总数的20%，导致穿山甲濒临灭绝。所有现存的8种穿山甲均被列为CITES附录I物种。但是，环境因素和人类活动究竟是如何导致其急剧缩减以及这种急剧缩减对遗传水平上带来的后果和其生存潜力的影响仍然未知，而这些信息对于穿山甲这一极度濒危物种的保护和管理计划的制定至关重要。

方法流程

研究结果

两个高质量穿山甲基因组组装

    研究人员以极度濒危的两个亚洲穿山甲,即马来穿山甲Manis javanica(MJ)和中华穿山甲Manis pentadactyla(MP) 为研究对象，基于Illumina测序技术和10X genomics技术组装了两个穿山甲参考基因组。MJ和MP基因组大小分别为2.45 G和2.40 G, scaffold N 50分别为13.85和7.77 Mb。组装质量远高于以发表的穿山甲参考基因组scaffold N50和1.97andl.88 Mb。高质量的穿山甲参考基因组不仅对穿山甲种群基因组分析很重要，而且对哺乳动物的研究也是非常必要的。

表1两种穿山甲基因组及比较

穿山甲重测序数据变异检测和非法交易穿山甲的种群身份确定

    74个马来穿山甲和23个中华穿山甲的群体重测序数据进行分析。群体结构分析发现马来穿山甲和中华穿山甲，两个物种都存在着显著遗传分化的两个群体，推断此研究中罚没的马来穿山甲的一个群体分布于内陆，另外一: 个群体来自于东南亚岛屿(除了爪哇岛)，而罚没的中华穿山甲的一个群体主要来自于中国南部，另外一个群体极有可能来自于缅甸，提出这些种群应该作为i 作者将穿山甲与其他物种的进行了比较，发现两个穿进化上独立的保护单元进行保护。

图1  穿山甲群体结构分析

近交水平和遗传负荷对穿山甲群体规模的影响

    穿山甲中广泛记录了最近由于人类活动导致的种群数量下降。种群历史动态分析发现由于两个穿山甲物种分布地不同，研究结果表明海平面的升降变化导致了马来穿山甲的群体分化和种群大小波动，而冰期气候变化和青藏高原隆升造成了中华穿山甲的群体分化和种群数量变化。除了历史的环境变化，近期的人类活动影响也导致了穿山甲有效群体急剧缩减，研究分析发现穿山甲物种的近交水平(inbreeding level) 和遗传负载(genetic load)显著增加，而且值得注意的是，对有害基因突变的富集分析结果显示，与癌症/ 疾病、胆固醇稳态等相关的基因显著富集，推测这些有害突变可能增加了穿山甲对疾病的易感性，降低 了它们适应环境变化和高胆固醇饮食(穿山甲以蚂蚁和白蚁等为食)的生存潜力。

图2  群体大小模型模拟推断出(A)MJ和(B)MP的群体演化史

总结

    这项全面的研究不仅提供了高质量的穿山甲参考基因组，而且还提供了有关穿山甲种群数量长期波动的驱动因素和最近由于人类活动导致的种群数量减少的基因组影响的有价值的信息，这对穿山甲保护管理和全球行动规划至关重要。

参考文献

案例九

研究背景

    喀斯特由石灰岩等高度可溶和多孔的基岩溶解而形成，通常是陡峭而高的悬崖，除了金属离子之外其他养分都很贫乏。乌叶猴属可分为戴帽叶猴组、郁乌叶猴组、银叶猴组和黑叶猴组4个组。其中，黑叶猴组全部分布于喀斯特石山区域，因此通称为“石山叶猴”。石山叶猴通常睡在洞穴或岩石庇护所下，可以很容易地在陡峭的岩石上行走、攀爬和跳跃。而他们饮用喀斯特洞穴的水，舔食石灰岩，并食用忍冬等含有更高钙含量的植物叶片，这些使得它们通常会摄入较高的钙含量。

方法流程

研究结果

黑叶猴基因组组装及阳性选择基因(PSGs)的鉴定及富集

    研究者对雄性T.francoisi进行基因组组装，使用Illumina(598.37 Gb)、PacBio(272.97 Gb)和Hi-C(151.6Gb ) 共组装2.87Gb基因组，contigN50为16.3Mb,并将基因组定位到22条染色体上，共25,421个蛋白编码基因被注释。

    黑叶猴与其他11个灵长类物种进行基因组比较，发现金丝猴与石山叶猴的分化时间为(9.30±3.30MYA), 鉴定到一些同源基因家族的扩张与收缩。在黑叶猴中鉴定出了130个阳性选择基因(PSGs)，仅在五种石山叶猴中共有的56个PSGs是与所有石山叶猴相关的阳性选择潜在基因。这56个PSGs在KEGG途径中显示出“钙信号”和“催产素信号”，以及“血管收缩”、“血液循环”和“肢体形态发生”的富集，暗示了石山叶猴对喀斯特 生境潜在的生理和形态适应。

图1黑叶猴比较基因组分析

信号通路相关基因的筛选

    与钙离子信号传导、钙离子跨膜转运以及细胞内钙离子调控相关的七个基因中，都观察到黑叶猴中有一个正选择的氨基酸替换，且该替换仅存在于所有石山叶猴。研究发现与“铁离子结合”和“阳离子转运”相关的基因组家族仅在五种石山叶猴中发生扩张，意味着这些基因家族的扩张发生在石山叶猴与雨林叶猴分化后，是在石山叶猴的共同祖先中发生(图2)。

    对位于细胞膜上的电压门控钙离子通道蛋白(CAV1.2)的点突变细胞钙离子成像实验和全细胞膜片钳实验，提示该基因的点突变可能是石山叶猴适应喀斯特环境的机制之一。

图2石山叶猴对高血钙离子浓度的基因组适应

石山叶猴和雨林叶猴的系统发育关系及种群历史分析

    乌叶猴属祖先在历史上约2.9个百万年前分化形成石山叶猴和雨林叶猴两大类群。希夏邦马冰期(XG, 1170-800千年前，KYA)期间，大部分雨林叶猴和石山叶猴经历了一次种群数减少，随后在中更新世时期(800-200 KYA)中有一次扩张。第二次下降发生在200 KYA,与倒数第二次冰期(PG, 200-130 KYA)和最一次a冰期重合(LG, 70-10 KYA)后。

图3叶猴的系统发育关系和种群历史动态

图4黑叶猴和白头叶猴毛色变异的基因组机制

黑叶猴和白头叶猴的分化和毛皮颜色变异的基因组机制

    黑叶猴与白头叶猴除毛色差异外，生存环境和习性极其相似，基于种群基因组学的选择清除分析(、θπ 比值和XP-EHH分析)提示在白头叶猴中，黑色素合成信号通路相关基因受到显著的正选择，且转录组分析揭示黑色素合成信号通路中的关键基因EDNRB在白头叶猴中的表达量远低于黑叶猴。因此研究推断EDNRB基因是在自然选择过程中，在白头叶猴遗留下来的环境适应性毛色表型的关键机制。

总结

    本研究借助二代、三代PacBio和HiC技术组装了雄性黑叶(Trachypithecus francoisi)高质量基因组，利用比较基因组、种群基因组及其细胞学功能实验，揭示了乌叶猴属中的石山叶猴种组物种适应喀斯特特殊生境的遗传机制，发现石山叶猴的钙离子通道蛋白(CAV1.2)具有有效减少钙离子内流的作用，从而保证了石山叶猴物种在高钙环境中的正常生活。

参考文献