浅谈纳米孔测序技术

1背景介绍

Nanorpore即纳米孔测序技术，又称第四代测序技术，是Oxford Nanopore Technologies公司研发的新一代的测序技术。目前测序长度可以达到150kb。这项技术开始于90年代，经历了三个主要的技术革新：一、单分子DNA从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。

2 测序仪介绍

Oxford Nanopore Technologies公司的当家明星产品MinION是世界上第一款掌上纳米孔DNA/RNA测序仪，它是一款便携式、实时、长读长和低成本的设备，也是目前市场上接受最广泛的纳米孔测序平台。它的特点是1）单分子测序；2）测序读长长（超过150kb）；3）测序速度快；4）测序数据实时监控；5）机器方便携带等。MinION的启动套装包含测序试剂和两张测序芯片，价格不到人民币1万元。MinION由一个USB接口连接到笔记本电脑上启动，现在还可以使用新开发的MinION伴侣——MinIT，一个预配置过的小型电脑分析仪，省去对笔记本电脑的需求.此外，Oxford Nanopore Technologies还推出了更高通量的台式设备GridION X5和PromethION，以及更袖珍的适合单次使用的Flongle，以适应对不同大小基因组以及更高覆盖率和样本量的要求。GridION数据产量是MinION的5倍。下图是MinION的结构图。

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PromethION是为了满足研究人员对高通量测序的需求而在MinION的基础上开发的，可以说PromethION是MinION的高通量升级版。PromethION是一款灵活的测序仪、高通量的设备，采用新的ASIC（特殊应用集成电路，目前的ASIC芯片有3，000个通道）芯片。它的模块化设计让用户能够根据需要，灵活调整通量和样品数量。流程也相当简单，特有实时的数据分析，因此无固定的运行时间，在到达预设的实验终点后即可停止。PromethION有48个flow cell（流动槽单元），可以单独运行也可以并行，适合1-192个样品。每个flow cell包括3，000个通道（channel），高通量、高样本量的PromethION数据产量约为MinION的300倍，每天可产生6.4Tb测序数据。在正常模式下，每秒可读取30个碱基；而在快速模式下，每秒读取500个碱基。快速模式让PromethION的通量和成本与HiSeq相当。Voltrax（完全整合的自动化样品制备系统，这个不足手掌大小的设备是便携的，可编程的，且一次性的，有6-12个样品输入口，能实现10分钟的样品制备）设备可叠放在PromethION的上方。99.8%的准确性相当高，且错误很容易通过计算来纠正。均聚物延伸也没有问题，因为纳米孔记录每一个碱基，而不管其前后的碱基。

3 测序原理介绍

Nanopore是一种单分子,实时测序的新一代测序方法，其以单分子DNA（RNA）通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。promethION与MinION的测序原理一致，由于MinION出来的比较早，是Nanorpore的经典款，故现在发表的文章大多是基于MinION做的，原理介绍也主要围绕MinION，故这里以MinION为例进行介绍，promethION基本一致。测序过程如下：

1. 解螺旋，将双链DNA解开成单链。

2. DNA单链分子通过一个孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子。蛋白分组结构图如下：

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3. DNA单分子停留在孔道中，有一些离子通过带来电流变化，而不同的碱基带来的电流变化是不同的。

4. 转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化。

5. 根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到碱基序列。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。每个碱基也有特有的平均停留时间。

具体测序原理如下图所示：

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DNA分子上的碱基序列从ATCGU5个碱基转换成电信号的整体流程如下：

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原理视频介绍：

http://www.365yg.com/i6468296757242495502/#mid=6717845000

4 Nanopore测序平台的优劣势

优势：

1， 仪器小，携带方便

作为Oxford Nanopore的“镇店之宝”，MinlON是目前世界上唯一上市的便携式DNA测序仪，也是目前该公司测序平台中最成熟、使用最广泛的一款。其外形比U盘大不了多少，凭借在埃博拉疫情爆发展现的出色性能而名声大噪，随后又被美国宇航局（NASA）送入国际空间站，在太空完成了DNA测序。

2， 碱基修饰的检测

以往对甲基胞嘧啶进行测序，都要先进行重亚硫酸盐转化，而纳米孔测序技术可以检测四种胞嘧啶（cytosine）碱基修饰，分别为5－methycytosine，5－hydroxymethycytosine，5－formylcytosine和5－carboxylcytosine。检测准确率为92％－98％。

3， 实时测序监控

对于临床实践，实时获取和分析DNA／RNA序列是一件很重要的事情。对于传统的NGS测序，做到这一点非常不易。但对于MinION，实现起来相对容易。这不仅是因为MinION体积小，易操作等，更是因为在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以检测并识别，这种设计允许用户在测序过程中根据实时结果做出一些判断。

实时测序监控对于MinION针对特定目标序列测序有重要的应用：当DNA片段通过纳米孔时，如果电流变化呈现与目标序列一样的趋势，则通过纳米孔。如果DNA片段与目标序列呈现不同的电流变化趋势，则不能通过纳米孔。通过这样的方式，实现目标序列的富集，从而显著减少测序时间，对于在野外和即时诊疗有重要意义。

4， 测得更长的read

用MinION测序仪，对于1D read可以获得300kb长的read；对于2D read可以获得60kb长的read。利用MinION测序仪产生的长read，研究人员设法填充了人参考基因组Xq24号染色体一个长50kb的gap。该区域存在多个CT47基因串联拷贝，研究人员利用MinION的长read判断该区域极有可能存在8个CT47基因拷贝（图3）。理论上，只要测序时提供的DNA不是碎片化的，而且没有卡在小孔中，将来会产生更多更长的reads，甚至可能达到整条染色体的长度。为了解决DNA卡在小孔中的问题，Oxford Nanopore公司在最新升级的MinKonw软件v2版中加入了一个名为“逐步激活”（progressive unblock）的新功能。之前的方法是利用反转电势来激活小孔，但这种方法往往会破坏通道；而新方法的处理方式则更温和，进而保证了更高的数据产量。

5， 结构变异的检测

NGS短序列的特征使结构变异的检测往往不准确。这个问题在癌症的检测中尤其严重，这是因为癌症组织中充斥各种结构变异。研究人员发现利用MinION测得的几百个拷贝的长read得到的结构变异结果比NGS平台测得的上百万read得到的结果更可靠。

6， RNA表达分析

对于RNA表达分析，NGS平台测得的短序列带来的问题是序列需要进行拼接，才能得到转录本。这给可变剪切研究带来困扰。因为通常情况下NGS测序不能产生足够的信息将不同形式的可变剪切区分开来。而利用MinION测序仪产生的长read，可以更好地解决这个问题。研究人员利用果蝇的Dscam1基因为例，其存在18，612种可变剪切形式，利用MinION测序仪可以检测到超过7，000种可变剪切形式，而这样的结果利用NGS的短序列测序是不能够获得的。

7， 自动化液滴式测序平台使单细胞等微量DNA三代测序成为可能

从长期发展来看，Oxford Nanopore正在研究一种新型的自动化液滴式测序技术，该技术将能够实现微量DNA的测序，包括单细胞测序。这项技术将结合VolTrax样本制备平台的元件和MinION测序仪技术，最终开发出一款目前还未命名的新仪器，这也将成为Oxford Nanopore下阶段的主要产品。据介绍，不同于将纳米孔插入芯片小孔顶部的隔膜中，这项新技术将通过两个微流控液滴接触面的纳米孔进行电流测定。为了达到这个目标，两个液滴（其中一个液滴溶液中包含纳米孔）在VolTrax设备中被拉得极为接近，并紧靠着引导电极。当液滴接触时，将在它们表面形成一个双层膜，然后施加电压，引起一个小孔插入液滴共有的膜区域中，DNA通过这个小孔从一个液滴移动到另一个液滴中，然后通过测定小孔中的电流进行测序，测序的过程将类似于MInION。

劣势：

Nanopore测序方法存在非随机的测序错误。比如Nanopore不能很好处理长于6个核苷酸的同聚物的测序，同时缺少碱基修饰检测的内参训练。如果这两个问题能够得到解决，共有序列（consensus）测序的准确率可以达到大于99．99％。