Nucleic Acids Research| oriTfinder: 细菌耐药质粒接合转移研究工具

oriTfinder: a web-based tool for the identification of origin of transfers in DNA sequences of bacterial mobile genetic elements

导读：

由于抗菌药物的不合理使用，病原细菌的耐药性日趋加剧。细菌可移动遗传元件（mobile genetic elements， MGE），如接合质粒和整合性接合元件(Integrative and conjugative element, ICE)，是细菌致病性和耐药性传播的重要载体。接合性质粒和ICE的接合转移区通常由四个模块组成：转移起点（oriT）区，松弛酶 (relaxase)，IV型伴侣蛋白 (type IV coupling proteins, T4CP)和细菌IV型分泌系统(type IV secretion system, T4SS)，展现出滚环复制和接合转移等典型的单链DNA自行转移特性。在接合转移过程中，松弛酶识单链DNA（ssDNA）转移起始位点（oriT），结合并切割，被切割的单链进行滚环复制，T4CP识别并与ssDNA结合，随后通过T4SS从供体细胞转移到受体细胞中。相对于接合性可移动元件，大量非接合（non-conjugative） 性可移动元件（MGE），包括可移动质粒和整合性可移动元件（integrative and mobilizable elements，IMEs），可以进行移动，但是不能进行自主传播，基因组上通常携带有限数量的mob基因用于其在接合中的自身DNA加工。有趣的是，携带功能性oriT序列的非接合MGE可以通过接合元件进行传播。例如，携带oriT的霍乱弧菌基因组岛可借由SXT/R391 ICE进行传播。SXT元件还可以介导质粒RSF1010的传播，该质粒编码对磺酰胺和链霉素的抗性。oriT区域的长度通常为数十至数百bp，包含保守的切口区域（位于nic位点的侧翼）和可变数目的反向重复序列（IR）。nic位点被松弛酶识别和切割，而IR参与松弛酶对nic位点的精确识别以及ssDNA转移的终止。因此，鉴定MGE序列中的oriT区域对于研究MGE的自主转移能力（self-transfer or mobilizing transfer capability）是非常重要的。

oriTfinder在线工具的开发：

截至目前，已有多种用于预测MGE T4SS的生物信息学工具，如SecReT4数据库，AtlasT4SS数据库，EffectiveDB数据库，基于web的T346Hunter和在线工具VRprofile。然而，这些数据库中都缺乏ssDNA转移起始相关的数据，包括oriT区域，松弛酶和T4CP。

为深度解读病原细菌的海量可移动基因组数据，该研究团队开发了生物信息学软件oriTfinder，用于快速识别质粒和ICE序列中的oriT、松弛酶、T4CP和T4SS等接合转移功能模块。在本研究中，通过文本实体识别和语义提取，广泛地收集了散布于文献和公共数据库的异质数据，梳理了1千多个接合转移起始位点oriT的信息，定义和审编了nic位点附近保守序列，构建了可靠的训练集。其次，提出基于nic位点保守序列查找和邻近松弛酶基因共定位的新策略来识别质粒或ICE中的接合转移起始位点oriT；并基于oriT、松弛酶、T4CP和T4SS等4个功能区的不同预测结果，归类为接合转移、非自主转移和不可转移的质粒或ICE。oriTfinder在线工具的输入界面可支持细菌全基因组序列或未注释的contigs；输出界面可将oriT和T4SS等复杂的预测结果进行可视化显示。此外，oriTfinder还提供了Linux本地版，可用于细菌基因组序列的批量分析。

实际案例：肺炎克雷伯菌是一种重要的病原菌，是世界范围内造成医院感染的重要病原体。它目前被认为是全球主要的抗生素耐药性来源和传播工具。在本项研究中，研究团队从GenBank中截至2017年12月1日的107个完全测序的肺炎克雷伯菌基因组中收集了311个质粒序列。这些质粒的不相容性由PlasmidFinder确定。使用oriTfinder，成功鉴定了这些质粒的转移区，包括oriT，松弛酶，T4SS和T4CP（Fig.1）。在311个质粒中，发现26.4%（82/311）具有一整套oriT，松弛酶，T4cP和T4SS，表明它们具有较强的自我转移能力。值得注意的是，在这82个接合质粒中，其中有63个质粒携带抗生素抗性基因（AR），表明这些质粒可能介导了抗生素抗性基因传播。例如，在分离自临床的肺炎克雷伯菌HS11286的111kb碳青霉烯酶编码（carbapenemase-encoded）的质粒pKPHS2中含有与oriTDB数据库中质粒R100同源的oriT区，其H值为0.51。此外，发现有12.2%（38/311）的质粒具有oriT和松弛酶，但缺乏T4CPs和/或T4SS，表明它们是潜在的可移动质粒，在这38个可移动质粒中，有31个携带获得性抗生素抗性基因，其可以通过接合性MGE进行传播。另外，61.4%（191/311）质粒未预测到相关的接合转移模块，而在这191个不可转移质粒中，有20个携带AR基因。

Figure 1. An overview of the oriTfinder-facilitated detection of putative oriT regions and three other conjugal modules in the complete sequences of 311 plasmids of the 107 completely sequenced K. pneumoniae genomes. The phylogenetic patterns based on the presence/absence of orthologous gene families of all the plasmids under analysis. A binary gene presence/absence matrix was created using OrthoMCL with default settings (4) and a hierarchical cluster result was shown by iTOL (5). The plasmids belonging to the reported incompatibility groups are marked in different colours. The six colour circles denote the regions (or genes) present in a given plasmid, including oriT, relaxase, T4CP, T4SS, AR gene and VF gene from the inside out. The gradient of colour of each circle represents the variable numbers of genes or gene clusters.

该研究团队进而以在第三代头孢菌素耐药肺炎克雷伯菌为研究模型，开展耐药质粒接合转移的实验验证工作，相关研究解读请查看。

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