上期《浅谈三维基因组多组学联合-part6》从分析的角度讲了一下以Hi-C为核心都有哪些方案，这期我们从文章组织架构的角度看看Hi-C是如何辅助阐释分子机制的。那么来看一下这篇Cancer Discovery的文献《Somatic super-enhancer duplications and hotspot mutations lead to oncogenic activation of the KLF5 transcription factor IF：26.37》
Background：
本文主要关注了KLF5，KLF家族在发育和疾病中起着重要的作用，KLF5 又是重要的原癌基因。文章系统的研究了编码区域和非编码区域序列的改变对于KLF5的影响，结果表明KLF5 的enhancer序列的改变会导致KLF5的激活，从而导致了细胞的恶性增殖。
材料与方法：
(1) 拷贝数变异分析
基于TCGA 33种癌症10844个样本进行了GISTIC (Genomic Identification of Significant Targets in 抗体: H3K27ac (Abcam, ab4729), KLF5 (Abcam, ab137676), p300 (Bethyl Lab, A300-358), V5 (Thermo Fisher, R960- 25).
基因组版本：hg19 , 比对：BWA, Peaking Calling : MACS2 ,Motif : SeqPos motif tool。
(4) Super enhancer 鉴定
多个细胞系的H3K27ac 合并成一个数据，并通过MACS2进行peak calling ，通过 ROSE 软件来鉴定super enhancer。
(5) 3C 验证
选取BICR31 和 BICR6 细胞系进行了3C实验，限制性内切酶为BglII。
（6）BETA 分析
Binding and Expression Target Analysis (BETA) 主要结合CHIP数据和RNA数据用于评估转录因子对基因表达的影响。
Result：
1.谁调控了KLF5？
针对TCGA的样本，作者通过分析6例头颈鳞癌的WGS数据发现在KLF5和KLF12中间非编码区域有着明显的扩增。发现这块（cluster of e1,e2,e3,e4）区域在各细胞系（8例头颈鳞癌，3例食管癌 ，3 胃腺癌）显著富集H3K27ac的信号，暗示着这块区域是潜在super enhancer。那么问题来了，这块区域到底调控谁呢？
通过公共的IMR90细胞系的hic数据，发现发生扩增的enhancer (e1，e2,e3，e4)和KlF5恰恰在同一个TAD内，而KLf12则处于TAD的边界上，这暗示着这块区域可能对KLF5有调控作用。通过3C技术验证了e1,e3,e4 对KLF5的调控作用。
文章构建了头颈鳞癌细胞系BICR31（～600kb enhancers 扩增）CRISPR抑制系统，通过招募sgRNA抑制e1,e3,e4的功能。通过qPCR发现只有e1,e3,e4同时被抑制时，KLF5基因的表达才显著下调。
2.KLF5调控了谁？
在充分研究了e1,e3,e4对KLF5的调控机制后，通过KLF5的CHIP实验，发现 KLF5 更多的和H3K27ac绑定起到super enhancer的作用。
文章还研究了KLF5对于其他基因的调控作用,通过Bind and Expression Target Analysis （BETA），可以发现 KLF5更多起的是活跃转录因子的作用（如图D）。
从图中可以看到，KLF5 转录因子和H3K27ac组蛋白信号显著富集于头颈鳞癌细胞决定KRT6A以及癌症相关基因ID1，LAMA3以及CCND1，暗示着KLF5有着显著的调控作用。为了验证这一结果，作者敲除了lD1附近的结合位点（e1,e2）,发现lD1的表达显著下降，说明KLF5对ID1有着直接的调控作用。
最终文章拨开了重重迷雾，从基因转录等角度我们揭示了KLF5的调控机制以及作用机制。
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