电转染实验常见问题解答（下）

以Entranster-E 电转染试剂为例

八、电转染实验，如何设置正确的siRNA实验对照组？

1.设置空白对照组，检验细胞生长状态。

2.设置阴性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂 + 阴性siRNA。

3.设置阳性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂+ 靶向siRNA 转染管家基因，比如GAPDH 或者 Lamin A/C，之后通过western blotting 或者 mRNA quantification检测基因的表达。

九、电转染实验时，DNA有什么要求？

使用高纯度、无菌和无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA要求无内毒素，OD值为1.8-2.0。不建议使用微型核酸制备试剂盒准备DNA，因为它可能含有高水平的内毒素。

不要使用仅用乙醇沉淀法纯化的DNA。乙醇沉淀法中残留的盐会引起电流改变并对电穿孔产生负面影响。 建议DNA的浓度范围为1-5

mg/ml。使用浓度较高的DNA可能会导致与细胞不均匀混合。而核酸浓度较低则可能稀释电穿孔混合物。

十、电转染实验时，siRNA有什么要求？

使用高纯度、无菌的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。建议在250-750nM最终浓度范围内的进行siRNA不同浓度的梯度实验。建议设置一个非靶向或无意义的siRNA对照序列，以验证实验siRNA的特异性。同时也验证，针对单个基因用多个siRNA序列实验产生的表型是否是由于脱靶效应所致。

十一、如何提高电转染效率？

1.  选择合适的电场强度

合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。

2.  选择合适的细胞

用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.

3.  质粒质量要好

应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒 素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。另外，DNA浓度不宜过高。

4.  选择合适的电转染试剂

电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。并且，Entranster-E可适用于lonza、Bio-rad、BTX等多种电转仪