祸祸细胞？从生信谈支原体污染检测

支原体污染是细胞培养中普遍存在的现象也是科研工作者的噩梦，支原体污染不及时发现往往意味着大量时间，精力和资金的浪费。对此nature的《Contamination hits cell work 》（https://www.nature.com/news/contamination-hits-cell-work-1.15632）进行了详细的报道。

    在细胞培养的过程中，支原体污染发生的频率很高，但常常为人所忽视，原因在于支原体污染的培养液可能不发生混浊的现象，这就导致了很难被肉眼所观察到。其次被支原体污染的细胞病理变化轻微或不显著 而且被支原体污染的细胞的细微变化也可由于传代，换液而缓解。只有个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落，以上种种原因导致了支原体污染很难被发现。虽然支原体污染很难被发现但是支原体几乎影响细胞的每一个方面。例如支原体会和宿主细胞竞争营养，改变细胞DNA、RNA和蛋白质合成状态，降低培养液中氨基酸和ATP水平，诱导细胞染色体改变，改变细胞膜抗原结构等。其结果是细胞增殖受到抑制，细胞死亡增加，DNA发生片段化，产生类似凋亡的形态特征。支原体造成细胞的改变大家可以参见《支原体污染细胞的危害有多大》《大量细胞研究被支原体污染所摧毁》《支原体污染细胞的严重影响》这几篇软文来一个定性的了解。

支原体污染可以采用多种方法进行检测。 检测方法

一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前实验上常用的检测方法有培养法， DNA荧光染色法， 聚合酶链反应(PCR)法， 电子显微镜法 ，相差显微镜检测 ，3-H胸腺嘧啶掺入法， 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 ，低张处理地衣红染色观察等等。

但很多时候，客户往往忘记了支原体污染的检测，而在真正拿到测序结果的时候才大呼”糟糕“（如NT库比对结果，支原体污染如红框所示），如果是测序据量小还好，毕竟造成的损失还能承受，如果是大数据量的测序，恐怕就得悔不当初了。

知道了支原体污染的风险，作为一名生信数据分析者，当然第一时间进行采用Blast进行NT库比对啦，那么具体的操作步骤又如何呢？

首先第一步在linux下安装blast并创建nt数据库

NT库格式如下：

第二步 由于NT库比对比较耗内存，那么针对clean的Reads，我们可以随机选取10，000 reads转换成fasta格式进行nt库比对。

第三步 采用以下命令进行NT库比对

blastn  -db  nt -evalue 0.001 -outfmt 5  -query  Lib1_blast.fasta -out  Lib1.xml  -num_threads 4 

通过blast NT库比对最终，我们就可以确定污染源了～～

但是要强调的是在做细胞实验时，一定要提前做好支原体污染的检测，不要等到测序结果出来了再追悔莫及～～