细胞培养——细胞传代

主要涉及到的溶液有四种：

1. DMSO+细胞培养液的冷冻液（1：9的DMSO和细胞培养液，e.g. 0.4mL DMSO + 3.6mL 细胞培养液）
2. 细胞培养液（10%胎牛血清，1%青链霉素）
3. PBS（磷酸盐缓冲液）
4. 胰蛋白酶

x.1 细胞孵化（以A594为例）

细胞存储在容量为1mL的冷冻管内（管内装有DMSO甘油和细胞营养液），放在液氮中低温保存（-80度）。

戴好手套，取出液氮中保存的细胞，放进到37度水中水浴加热，等到无菌管内冰块融化。

从冰箱中取出装有细胞培养液的试管，用酒精消毒手套和试管后，将试管放置到细胞培养箱等待15min，等到细胞培养液恢复到37度的合适温度。

关闭超净台的杀菌，打开照明，打开通风，带好手套，每次将手伸入细胞培养箱和超净台时候都需要将手套和器具用酒精消毒。

在超净台中，将1mL冷冻管内细胞移至细胞培养瓶中（可以分装，仍然按照1：7或者1：8的配比加入细胞培养液），加入7-8mL细胞营养液（why？），放入到37度+5%CO2的细胞培养箱中培养4h，等待细胞贴壁完成（用显微镜观察）。

细胞贴壁后，倒掉细胞培养瓶中的细胞营养液（因为DMSO对细胞有毒），加入4mL细胞营养液培养2天左右后进行传代，在瓶子上记录好时间，并记录第一代。

将瓶子放入到细胞培养箱中培养。将超净台的废液和用完的物品丢弃，将纸喷上酒精后，从内向外擦拭；关闭通风，照明，打开杀菌，将超净台玻璃关上。

x.2 细胞传代

等待2天-7天。戴好手套，对手套消毒后，取出细胞培养箱中的上一次传代的亲代细胞，在显微镜下观察细胞是否已经大量贴壁，如果已经大量贴壁则进行传代。

戴好手套，从冰箱中取出PBS，细胞培养液，胰蛋白酶，对试管和手套消毒后，将试管放到细胞培养箱中等待15min左右等待液体恢复到37摄氏度。

关闭超净台的杀菌，打开照明，打开通风，带好手套，每次将手伸入细胞培养箱和超净台时候都需要将手套和器具用酒精消毒。

消毒，将需要的试管和装有亲代细胞的细胞培养皿取出，放入超净台中，晃一晃细胞培养皿（把死细胞晃散），将亲代细胞中的细胞培养液全部倒掉。

加入2mL的PBS（为了将培养液去除，细胞培养液和胰蛋白酶是相冲的），晃一晃后将PBS倒掉。

加入1~2mL的胰蛋白酶，s.t. 贴壁细胞完全覆盖，将细胞培养皿放入到恒温培养箱中等待2min（这个步骤需要快速，为了让80%的贴壁细胞还有小尾巴粘在培养皿上悬浮，20%细胞完全脱离）。

取出培养皿，用显微镜观察，如果80%细胞仍然贴壁且悬浮，则直接进行下一步，如果有大量细胞完全脱离，则进行下面的补救措施。

假设：前面加入的是2mL的胰蛋白酶，则此步溶液的全部体积为2mL。

取出上清液1mL，1mL，分别加入到离心管中，离心装置需要成对配比旋转。

将离心管以500rpm，25摄氏度旋转5min。

取出离心管，丢弃上清液后，加入1mL细胞培养液，摇晃离心管使得沉淀的细胞溶解。

将2mL全部的溶液加入到细胞培养皿中，摇晃均匀后，再按需求（如每1mL）装到原细胞培养皿中。

如果没有大量细胞完全脱离，则将细胞培养皿中的胰蛋白酶溶液全部倒掉后，再加入4mL细胞培养液，使用5mL枪管或者移液枪将培养液吸起来后，先用力击打瓶壁（s.t. 贴壁细胞下来），再用力击打瓶底三四次（s.t. 打散），在显微镜下观察，直到细胞全部悬浮后，去除头0.5mL和尾0.5mL，再从中取1mL的细胞培养液分别封装到3-4个细胞培养皿中，再加入3mL的细胞培养液，使得每一个细胞培养皿中的总容量为4mL；在细胞培养皿上记录时间和传代次数。

将细胞培养皿存放到恒温培养箱中进行培养2天后再传代。