Trends Biotechnol | 单细胞分析循环肿瘤细胞
原创 huacishu 图灵基因 2022-08-30 11:43 发表于江苏
收录于合集#前沿生物大数据分析
撰文：huacishu
IF=21.942
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亮点：
1、作者概述了用于CTC单细胞分离和分析的尖端技术；
2、作者还强调了使用单细胞分析平台进行癌症管理的CTC的生物学特征、临床应用和治疗潜力。
澳大利亚悉尼科技大学Majid Ebrahimi Warkiani教授课题组在国际知名期刊Trends Biotechnol在线发表题为“Single-cell analysis of circulating tumour cells: enabling technologies and clinical applications”的论文。循环肿瘤细胞（CTC）的多模式分析有可能为癌症的发展和转移提供新的见解。本文中，作者概述了用于CTC单细胞分离和分析的尖端技术。此外，作者还强调了使用单细胞分析平台进行癌症管理的CTC的生物学特征、临床应用和治疗潜力。
分析CTC的重要性
近年来，对驱动肿瘤进展和转移的分子变化的理解有所提高，这使实体瘤的临床治疗朝着更加个性化的方向发展。确定癌症发生和发展的基因组驱动因素有助于新一代治疗剂的临床开发，称为靶向治疗。这些药物通常靶向控制癌细胞增殖和其他生存机制的基因产物。然而，这些靶向治疗常常通过癌基因突变或旁路信号通路的激活而导致治疗抵抗。由于肿瘤的大小和位置因素，使用组织活检通常是不可能的。
另一种方法涉及分析CTC，包括单个细胞和细胞簇。CTC是指从原发性或转移性肿瘤中释放的血液循环中的癌细胞群（图1）。对CTC进行的全基因组单细胞RNA测序（RNA-seq）和DNA测序为实体肿瘤患者的CTC异质性和靶向治疗耐药机制提供了新的见解。在这篇文章中，作者描述了单细胞分析技术的最新进展，全面讨论了分析单个和集群CTC的每种方法的优缺点。此外，还强调了单个CTC和CTC聚类分析在监测癌症患者对个性化药物的靶向治疗反应中的临床应用。
CTC的细胞和分子特征
CTC之间的表型变异表明存在特定的CTC亚群，这种变异可能赋予不同的转移潜能。许多研究已经发现上皮-间充质转化（EMT）与各种癌症中获得干细胞特性之间的联系。除此之外，一些研究还通过在各种类型癌症的单个和聚集的CTC上检测到的免疫检查点蛋白程序性死亡配体1（PD-L1）的表达，强调了CTC在免疫逃逸机制中的作用。
血液中CTC的数量取决于不同的因素，如癌症类型和疾病状态。然而，每107个白细胞的CTC计数通常在1到100之间。虽然检测CTC由于其罕见性而具有挑战性，但可以利用表型和生物学属性来富集并最终在其他外周血细胞中分离CTC。
利用CTC基因组分析肿瘤异质性
CTC计数具有预后价值，捕获的CTC的分子特征和功能测试可以更好地了解疾病状态和潜在的治疗方案。最近对单个CTC的研究发现了CTC对治疗反应的克隆和动态进化的关键见解。CTC的存在或不存在可进一步用于揭示在肿瘤和转移演变过程中激活或改变的分子途径。
CTC单细胞分离技术
虽然传统上通过常规成像分析CTC，允许使用少量标记物进行CTC计数，但富集和单细胞分离技术的出现使CTC的下游分析具有更深入的特征，这提供了原发肿瘤的关键信息。然而，富集样品中CTC的低回收率和背景细胞的高污染常常给CTC的分子和功能表征带来技术困难。因此，使用单细胞分析技术可以增强CTC的分析，并可以确定CTC作为癌症生物标志物的潜在临床应用（图2）。
有限稀释
有限稀释，也称为连续稀释，是一种简单且经济有效的方法。该方法可以使用普通手持吸管或移液器实现，因此是一种低成本方法。但鉴于这些细胞稀少，这种方法不太利于在单细胞水平上分离CTC。还应注意的是，现代高通量单细胞基因组学仪器，如液滴和纳米孔系统，使用有限稀释来最小化细胞包封期间的倍增率。
微量取样和操作
从富集样品中手动分离单个CTC的另一种方法是使用超薄玻璃毛细管制成的微量移液管。在显微镜下分析富集的样品，并且通常基于荧光标记和形态学来识别感兴趣的细胞。通过手动微量移液进行单细胞分离的主要缺点是效率低、劳动强度大以及对操作员技能的依赖性。
为了克服这些限制，开发了商业化产品，以在短时间内实现细胞检测过程的自动化（图3）。尽管自动微操作器具有基于细胞形态和生物标记物以无人工和非侵入性方式识别、分离和转移细胞的优势，但该方法在处理粘附细胞时仍存在高成本、系统复杂性和低转移效率的问题。
激光捕获显微切割技术
激光捕获显微切割（LCM）是一种组织捕获技术，用于从大部分固体组织切片中分离单个细胞。该技术也被用于将靶细胞固定在载玻片上从富集样品中分离CTC。使用高度精确的靶回收分离细胞，然后将其转移到管或孔中用于各种分析，包括基因组学和转录组学分析。LCM是劳动密集型、耗时的，并且在处理悬浮细胞时需要固定样品。
荧光激活细胞分选
荧光激活细胞分选（FACS）是一种高通量流式细胞技术，能够通过荧光标签来表征、检测和分离细胞，并可以使带静电的液滴（包含细胞）通过高压电场来分选细胞。FACS技术允许将含有单个细胞的纳升级别的液滴分离和沉积到孔板中。然而，由于系统稳定和染色的样本不足，以及无法分离具有低表达目标蛋白的细胞，FACS在处理低样本量（例如富集的CTC样本）时可能受到限制。
液滴生成器
液滴生成器利用微流体的能力精确处理微小体积的液体（图2）。除了高通量基因组分析外，还可以通过合并、分类和分裂来操纵液滴，以测试液滴大小、pH值、变形和行为。基于液滴的分离在研究CTC的代谢活性方面具有潜在的应用。尽管液滴生成器具有高吞吐量，但由于系统稳定时间和低捕获率，在处理低样本输入时，可能导致高细胞损失。此外，液滴生成器具有较高的设置和运行成本，需要专业技术来操作，这可能限制这些装置的可访问性。
纳（微）孔
与液滴系统类似，通过将单个细胞与用于下游分析的条形码捕获珠配对来操作纳米孔。这种方法导致许多孔不包含细胞，因此具有多个细胞的孔的风险降低，但由于每个孔包含磁珠，因此保留了高细胞捕获率。一般来说，纳米孔操作简单，成本低，并允许并行化；然而，这些技术经常遭受交叉污染，并且不完全适用于运行有限的样本，包括CTC和其他稀有细胞。
集成流体电路
集成流体电路利用气动膜阀，通过空气加压，以偏转弹性体并控制微米尺寸通道内的流体运动。在这种技术中，细胞通常被封装在微室中，在微室内进行分析（图2）。然而，这些系统通常在吞吐量方面受到限制，并且具有高复杂性。
介电电泳与光流体学
介电电泳（DEP）是一种由于不均匀电场而对介电颗粒施加力的现象。DEP通过微流体和微电子的结合，利用电动原理来操纵单个细胞。类似地，基于光流体的隔离方法将光学和微流体相结合，以精确操纵颗粒和细胞。这些设备提供了对细胞处理的高水平控制，在阵列中有效地用于隔离单个细胞，并已证明适用于CTC研究。然而，高成本是DEP和基于光流体隔离装置的临床适用性的主要缺点。
CTC单细胞分离的障碍
虽然可以利用CTC的物理和生物学特性的差异将其从血液中分离出来，但目前没有单一的方法可以确保在一个设备中捕获来自各种癌症类型的所有CTC。例如，并非所有的CTC都比它们的非癌对应物大，也并非所有CTC都表达与血液中正常发现的细胞不同的细胞表面标记物（图4A，B）。
CTC单细胞分析在肿瘤靶向治疗中的临床应用
个性化癌症治疗旨在根据肿瘤的个性化基因组图谱治疗患者。通过单细胞分析考虑肿瘤克隆进化研究，识别这些突变可用于监测治疗压力下的肿瘤进化轨迹，并允许给予适当的治疗方案。单细胞分辨率下CTC的分子特征可以帮助识别和分析肿瘤微环境（TME）中的耐药克隆。
迄今为止，大多数评估CTC基因组异常的临床研究强调了可能改变靶向治疗效果的基因突变的存在，包括但不限于EGFR、KRAS、HER2、PIK3CA、ALK和ROS1中的突变、重排或扩增。例如，使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）靶向突变的EGFR可提高NSCLC患者的存活率。许多研究报告了在捕获的CTC中检测到的突变。
由于KRAS突变的CTC可以逃避EGFR-TKI治疗，因此使用CTC持续监测KRAS的突变状态可能有助于早期检测对EGFR-T KI产生的耐药性。在原发性和转移性乳腺癌中，PIK3CA突变已被引入为HER2靶向治疗的主要分子耐药机制之一。此外，据报道，乳腺癌和前列腺癌患者的耐药发展与CTC中间充质标志物的表达呈正相关。综上所述，这些临床前和临床发现突出了单细胞CTC基因改变分析的预测能力，以及此类分析在靶向治疗期间显示干细胞表型的CTC纵向研究中的益处。
结论和未来展望
CTC计数研究一直显示CTC数量与疾病结果之间存在联系。CTC计数被认为是一种强有力的预后手段，表征CTC的单细胞技术提供了有关转移和治疗抗性机制的细节。这使我们对CTC异质性和潜在的原发肿瘤有了独特的认识。现代单细胞基因组学方法提供的特征提供了患者肿瘤的细节，超出了传统的基于图像的CTC计数。
由于癌症是一种复杂的疾病，通常由涉及多个基因改变的多个因素引起，因此真正了解癌症范围内CTC和CTC簇的临床相关性并非易事。这将涉及在不同治疗条件下对许多疾病处于不同阶段的患者进行的广泛研究。加速该过程的一种方法是开发可与高分辨率分子分析工具结合的高效分离方法。尽管存在缺点，但毫无疑问，基因组分析能够并且已经提供了更深入的CTC特征。临床研究表明，这可能会提高个性化靶向治疗的患者分层能力。
进一步了解CTC和CTC簇如何与癌症进展和治疗选择相关的另一种方法是生成用于分子分析和药物筛选的CTC细胞系和CTC衍生异种移植物（CDX）。然而，细胞系的体外扩增或从CTC产生CDX预计会对分离的CTC施加选择性压力，导致潜在变化。此外，不可能建立一个平台来长期研究CTC簇的免疫成分，因为CTC簇在增加转移潜能方面起着关键作用。因此，虽然在确定CTC的合适生长培养基后，CTC扩增可能是合适的解决方案，但这些药物筛选试验通常需要大量时间/成本，并且可能不会对每个患者进行CTC扩增。
通过将CTC的高分辨率单细胞分子表征结果与药物筛选相结合，有可能将CTC和CTC簇的表型和基因组图谱连接起来，以确定固有的药物敏感性。如果药物敏感性与CTC和CTC簇的分子和表型特征密切相关，就有可能找出针对个别患者的最佳治疗方法，并随着疾病的进展进一步改变治疗方法。
因此，为了实现临床环境中CTC分析的集成，富集平台需要；（i） 操作简单且具有成本效益，（ii）适用于广泛的癌症，（iii）允许在诱导任何生物变化之前快速分离CTC和CTC簇，以及（iv）可以与当前新兴的下游高维分子分析兼容格式结合。综上所述，作者认为，CTC分离的技术改进、利用空间转录组学和蛋白质组学等最新技术对富集的CTC进行功能分析，以及体外扩增CTC用于药物敏感性测试，是突出CTC分析作为临床实践中潜在的癌症诊断和预后生物标志物的关键。
教授介绍
Majid E.Warkiani博士是澳大利亚悉尼UTS生物医学工程学院的教授。他获得了南洋理工大学（NTU）的机械工程博士学位，并在麻省理工学院（SMART Center）接受博士后培训。他是NHMRC-CD研究员，也是UTS生物医学材料和设备研究所（IBMD）和健康技术中心（CHT）的成员。他还是澳大利亚-中国护理点测试联合研究中心的组长和联合主任。他因其卓越的研究成果获得了多项奖项的认可，包括麻省理工学院技术评论35岁以下创新者奖（2016年）和南洋青年校友奖（2017年）。
Warkiani教授目前的研究活动集中在以下三个关键领域：（i）微流体，涉及设计和开发用于诊断和治疗应用的粒子和细胞分选（例如循环肿瘤细胞、胎儿细胞和干细胞）的新型微流体系统，（ii）芯片上器官，涉及新型3D芯片上实验室系统（例如，芯片上肺、芯片上肿瘤）的制造和表征，以模拟组织和器官的生理功能；以及（iii）3D微打印，涉及设计和开发用于基础和应用研究的新型微型系统（例如微型混合器、微型旋风器）。Warkiani是惯性微流体的先驱之一，他在理论和新应用方面为推进该领域做出了重大贡献。Warkiani的研究愿景是将3D微打印和微流体技术的进步结合起来，为医疗和生物技术部门量身定制成本效益高的细胞分选技术。Warkiani发明并展示了多种用于诊断和治疗目的的癌细胞分离、干细胞纯化的平台技术。这些平台目前正由澳大利亚、新加坡和美国的公司进行商业化。
参考文献
Radfar P, Aboulkheyr Es H, Salomon R, et al. Single-cell analysis of circulating tumour cells: enabling technologies and clinical applications. Trends Biotechnol. 2022;40(9):1041-1060. doi:10.1016/j.tibtech.2022.02.004.