2022-05-11

Cell | 药物靶点的组织原位标记和成像新工具

原创 存在一棵树 图灵基因 2022-05-11 07:03

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：存在一棵树

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亮点：

开发了在完整组织中以细胞分辨率观察药物-靶标相互作用的工具CATCH ，允许以亚细胞分辨率对目标结合的药物分子进行特异性和稳健的原位荧光成像，并能够识别目标细胞类型。

2022年4月28日，斯克利普斯研究所的Ye Li教授团队在《Cell》上发表了一篇名为“In situ identification of cellular drug targets in mammalian tissue”的文章。本文介绍了该团队开发的一个可在哺乳动物组织中以亚细胞分辨率对小分子药物-靶标相互作用进行原位标记和成像的工具。

在化学生物学和药物开发中，小分子的靶标识别和验证一直是一个长期的挑战。荧光光学显微镜虽然对蛋白质和核酸等内源性生物分子可高分辨率原位成像，但对于外源性小分子，尽管存在点击化学 (CC) 策略与化学蛋白质组学方法可有效识别各种生物环境中的药物靶标，但由于完整组织中的信噪比（SNR）差，难以实现体内药物-靶标相互作用的高分辨率空间成像。

如图1所示，该团队通过修改 CC 并将其与组织清除相结合，开发了一种方法，可以在哺乳动物组织中以亚细胞分辨率对小分子药物-靶标相互作用进行原位标记和成像的工具，清除辅助组织点击化学 (CATCH)，基于铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC）。该团队通过探索一组特征良好的内源性大麻素水解酶共价抑制剂，脂肪酸酰胺水解酶(FAAH) 抑制剂PF7845，从而建立一个可以评估药物靶点可视化的模型系统。炔烃修饰的类似物 PF7845-yne与 PF7845 具有相似的选择性，并且能够通过基于活性的蛋白质分析 (CC-ABPP)选择性地检测全脑裂解物中的 FAAH，但由于SNR较差，PF7845-yne-Alexa647处理的小鼠脑切片中的直接FAAH结合成像未能揭示细胞靶标。但利用CATCH方法，首先使用THPTA、BTTPA 和 BTTP显着消除了载体处理样品中的背景信号； 随后利用CLARITY、150 μM CuSO 4和 300 μM BTTP去除脂质，极大地促进了组织中内源性生物分子的可视化。

接下来该团队通过进行药理学阻断实验来确定 CATCH 信号是否对 FAAH 的体内PF7845-yne 参与具有特异性。药理学和遗传学结果表明，CATCH 可以在药物治疗的小鼠组织中以高特异性可视化靶标接合。

在验证了 CATCH 检测 PF7845-yne 和 FAAH 之间相互作用的能力后，团队通过研究结构不同的FAAH 抑制剂BIA-10-2474和单胺氧化酶 (MAO) 抑制剂pargyline的靶点组合来评估其更广泛的效用。如图2所示，更高分辨率的成像显示 FAAH 抑制剂主要针对新皮质和海马中的神经元样结构，而pargyline-yne 主要与整个大脑的血管样结构结合；表明 BIA10-2474-yne 与脑桥的网状被核 (RtTg)中的脱靶位点结合，证明了CATCH 能够以细胞分辨率发现药物靶点。除此之外，CATCH还可与荧光标记复用以识别靶细胞类型。

接下来该团队探索了 CATCH 是否可以成像组织中亚细胞单位中的药物-靶标相互作用，使用MAGL 抑制剂 MJN110 的充分表征的炔烃类似物，靶向单酰基甘油脂肪酶(MAGL)。如图3所示，结合突触蛋白和微管相关蛋白 2 (MAP2) 免疫染色显示MJN110-yne 信号在低剂量时仅限于突触蛋白阳性的轴突末端，而在高剂量时扩散到神经元胞体。以上数据表明 CATCH可以检测跨亚细胞区室的靶向和脱靶 MJN110-yne结合，即在亚细胞分辨率下揭示药物结合。

对于任何药物，炔烃修饰可能会改变其药代动力学(PK) 特性，可能导致不反映母体药物的 CATCH 标记模式。因此，该团队设计了一种反向标记方法来检查 CATCH 探针的分布，以可视化体内药物-靶标相互作用的剂量依赖性。如图4所示，在这种竞争性CATCH 方法中，动物首先接受一定剂量范围的亲本药物治疗，然后是单次高剂量的炔烃探针；随后基于以解剖学特异性方式对信号的竞争性阻断来记录亲本药物的剂量依赖性靶标参与。以上数据CATCH 可以测量剂量依赖性的药物靶点参与度。

综上所述，开发了一种新方法，可以在完整组织中以亚细胞分辨率可视化体内共价药物-靶标相互作用，其中保留了天然的解剖学和分子特征。该方法特别适用于果大脑等复杂器官类型的不同区域由于例如不同的接近度而受到不同的药物暴露到脉管结构，或者如果稀有细胞类型包含大多数药物靶标。

教授介绍

YeLi，现任斯克利普斯研究所神经科学系与分子医学系的助理教授。2006年，Li从清华大学本科毕业，取得生物科学学士学位；之后在麻省理工学院和哈佛大学的 Broad 研究所学习至2008年；2012年，获得哈佛大学医学院公共卫生中心的生物科学博士学位；2013-2017 年在斯坦福大学霍华德休斯医学研究所进行博士后研究。目前Li的研究内容为大脑如何适应急性和慢性代谢变化，以及这种适应反过来如何影响CNS在生化、细胞和回路水平上对有机体生理学的控制。其长期目标是利用这些适应性背后的分子和电路机制来靶向代谢紊乱，包括肥胖和2型糖尿病以及某些神经退行性疾病。其团队采用并设计了针对全脑结构映射、体内多区域Ca2 +成像和活动/连接定义的光遗传学新型系统工具；并开发和应用高通量筛选与基于电路的工具相结合，以释放完整哺乳动物大脑中大规模无偏差筛选的力量。

参考文献

1、Zhengyuan Pang, Michael A. Schafroth, Daisuke Ogasawara, YuWang, Victoria Nudell, Neeraj K. Lal, Dong Yang, Kristina Wang, Dylan M.Herbst, Jacquelyn Ha, Carlos Guijas, Jacqueline L. Blankman, Benjamin F.Cravatt, Li Ye,In situ identification of cellular drug targets in mammaliantissue,Cell,2022,ISSN 0092-8674.