cellranger使用前数据准备

一般来说，我拿到的测序公司给我交付的数据是可以直接作为cellranger的input的。

但是也存在命名不规范，报错的情况，所以自己需要手动的修改文件的名称，查资料需要修改成为以下格式：

Sample Name_S1_L00[Lane Number]_[Read Type]_001.fastq.gz

其中Read Type

I1：Sample index read (optional)

R1：Read 1

R2：Read 2

对于下载的公共sra数据：

fastq-dump SRR2090164.sra --gzip --split-3 -O .

其中：

--gzip将生成的结果fastq文件进行压缩

--split-3其实有点复杂：首先它是分割的意思，-3实际上指的是分成3个文件，它诞生的时间比较早，是在1000 Genome的Phase1阶段产生的。如果结果发现只有一个文件，说明数据不是双端(第三个文件太大会覆盖前两个)；如果结果有两个文件，说明是双端文件并且数据质量比较高(没有低质量的reads或者长度小于20bp的reads)；如果结果有三个文件，说明是双端文件，但是有的数据质量不高，存在trim的结果，第三个文件的名字一般是：.fastq， 而且文件也不大，基本可以忽略。

利用cell ranger软件分析，一般需要两个输入文件，其中一个是测序reads，另一个是UMI+Barcode文件，那么只生成一个文件是不够的，因此可以换个参数

使用另外一个参数--split-files来替代--split-3 ，就可以生成三个文件，其中第一个文件的所有序列都是8bp，第二个文件都是26bp，第三个文件都是91bp，初步判断，第三个文件是测序reads

但是还是需要手动的修改名字成为相应的格式，不然cellranger总觉得识别不了。

首先，1-26个cycle就是测序得到的26个碱基，先是16个barcode碱基，然后是10个UMI碱基；

然后，27-34这8个cycle得到的8个碱基，就是i7的sample index；

最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads。

====其实到这里我还是不太理解测序建库的流程，汗=======================

那么为什么需要需要index和barcode来区分cell，为啥要放这么多的fq文件，单细胞转录组对我来说就是几千个的转录数据而已。

i7 sample index：是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow cell上或者同一个lane上进行混合测序（multiplexed）。当然可以自己指定index，针对不同项目的index也是不同的。它的作用就是在cellranger的mkfastq功能中体现出来的，它自动的识别样本的index，将具有相同4种ologo的fq文件组合在一起，表示同一个样本。（其实我还是不理解为啥要用4种）我自己理解的就是这个index是用来区分样本的。

barcode：顾名思义，是为了区别GEMs，为细胞做了一个标记。

UMI（它是为处理PCR扩增偏差而生的）：有4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每个mRNA随机连上一个UMI，结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。它对原始样本基因组打断后的每一个片段都加上一段特有的标签序列，来区分同一样本中成千上万的不同的片段，在后续的数据分析中可以通过这些标签序列来排除 DNA 聚合酶、扩增以及测序过程中所引入的错误。

一般UMI由大约10nt的随机序列（如：NNNNNNNNN）或者简并碱基（根据密码子的兼并性,常用一个符号代替某两个或者更多碱基，如NNNRNYN）。它和样本标签（sample barcode）不同，UMI是针对一个样本的不同片段，而样本标签是为区分不同样本 加上的标签序列。

一个样本只能有一个相同的样品标签，但可以有成千上万的分子条形码。

设置UMI目的：PCR 和测序过程中的错误是随机发生的，根据UMI可以去除冗余，降低低频突变的假阳性率。

但是，我们收到公司最新的交付结果一般含有2个文件：

单细胞原始数据

公司的人反馈：

R1: barcode(16bp)+UMI(12bp)+reads

R2: reads