1048年，当时来自意大利南部阿马尔菲公国的商人建起一座医院来庇护和照顾前往圣地的朝圣者。当时的朝圣者旅馆建在施洗者圣约翰修道院旁边，由本笃会修士提供服务。1113年，教宗帕斯卡二世正式批准成立骑士团，将其置于教廷的庇护之下。名声鹊起的教团得到了罗马教廷的正式承认后，欧洲皇室也纷纷跟着表态，教团因此得到了许多来自欧洲皇室的直接支持。有了这样的背景后，教团的影响力得到了爆炸式的发展，医院扩建自不必说，他们还很快就在十字军建立的基督教王国中逐渐将圣地一线的所有其他医院都收归麾下。
骑士团全称是——“耶路撒冷、罗得岛及马耳他耶路撒冷圣约翰医院骑士团”，由“被祝福的杰拉尔德”在耶路撒冷成立，是世界现存最古老的骑士团，以其军事和慈善性质而驰名。最初的时候，人们称其为”医院骑士团（Knights Hospitaller）。骑士团被授予了自行选举领导人的权利，任何世俗政权或宗教机构都无权干涉。其成员被称为骑士，受“守贫、守贞、服从”三条隐修誓言约束。
同时还诞生了那句著名的温暖人心的“医院骑士团”口号——“Defence of the faith and assistance to the suffering（守护信仰，救助苦难）！”
马耳他骑士团徽章(图片来源：维基百科）
马耳他骑士团旗帜(图片来源：维基百科）
时至今日仍在使用的八角十字架标志，成为了“医院骑士团”的著名象征。它也被称为马耳他十字架，出现在骑士团修士的黑色教袍上，象征着耶稣的受难。马耳他十字的形状一直延续至今。十字架的四端代表了四种基本美德，即明智、正义、节制和勇敢，而八个角代表了《马太福音》中所记录的耶稣登山宝训的天国八福，同时也代表着当时的八个兵团。
在十字军东征期间，马耳他骑士团受命承担起了保护朝圣者的责任，因此把军事任务加入了骑士团的使命中。当时，一位来自法国并曾与“医院骑士团”并肩作战过的骑士，在写给其家人的信中曾这样介绍他们的作风：“部队在行军时路过一条小溪，所有的人都纷纷脱离大队到溪边喝水饮马，唯有身着黑袍的医院骑士排起了横队，警惕的观察着四周的动静。在其他十字军又重新归队之后，他们的长官才下令休息。这些优秀的骑士这才来到溪边稍作休整，整个过程有条不紊，甚至听不到一句互相交谈的话语……“
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2013年 马耳他骑士团成立900周年纪念活动（图片来源：http://www.cq67.com/yshwh/hwys/187591.html）
1291年，骑士团被迫从圣地撤出后在塞浦路斯做了短暂的停留。之后他们在热那亚的械协助下占领了罗德岛。1310年，大团长福尔克斯·德·维拉赫又将骑士团迁至罗德岛。在其后约两百多年间，这里将成为“医院骑士团”的家园。为了继续履行保卫基督教世界的责任，骑士团很快建起了一支强大的海军舰队。舰队在东地中海巡逻，消灭任何来自巴巴里海盗和奥斯曼帝国军队的威胁。当时在大海上航行的舰船只要挂上了医院骑士团的红色十字标识，便能令一种宵小望风而逃。由于圣战热情在欧洲的普遍降温，为了获取更多的支持，医院骑士团在欧洲的宣传公关也变得前所未有的积极。他们成功的通过教友的游说和传播各种各样的英雄故事将罗德岛塑造成了欧洲人民眼中的骑士天堂，是神圣的战士们在与异教徒鏖战之后前往的花园般的避难所。骑士团还得到了一些圣物，诸如耶稣荆冠上的一根刺以及圣人约翰的右臂等，大力倡导欧洲各阶层的信徒到罗德岛朝圣。因为宣传得特别成功，医院骑士团在这一时期的文献中经常也会被称为“罗德岛骑士团”。
骑士团还根据骑士的籍贯而划分成不同的兵团（Langue），最初的七个兵团分别是普罗旺斯兵团、法兰西兵团、奥弗涅兵团、意大利兵团、阿拉贡及纳瓦拉兵团、包括苏格兰及爱尔兰的英格兰兵团以及德意志兵团。1492年，当卡斯蒂利亚-莱昂及葡萄牙联合王国成立时，骑士团又设立了第八个兵团。每个礼拜堂都有自己的小修道院、辖区和管理地。历史上的马耳他骑士团由大团长及理事会领导，铸造自己的货币。
1522年，罗德岛遭到奥斯曼帝国苏莱曼大帝的舰队袭击，双方激战了数月时间。这次的兵力达到了惊人的20万。血腥的围攻从6月一直延续到12月，双方都被拖至了极限。攻击方的奥斯曼帝国付出了极其惨痛的代价，损失了超过两万名士兵（一说四万），士气普遍低落且军中疫病横行；防御方的医院骑士团也好不到哪去，7，500名骑士团战士最后仅剩不到1000人还能作战，而几乎所有的城垣和要塞都已经化为了一片瓦砾。在欧洲各国作壁上观的情况下，医院骑士团最后还是无奈的选择了投降。或许是因为急于结束战斗，或许也是骑士团悲壮的抵抗博得了苏丹的尊敬。总之，奥斯曼帝国给医院骑士团开出了一份极其宽厚的投降条件：骑士团战士被给予了12天的时间收拾行装，可以保留自己的武器装备、可以带走全部的财产和任何他们认为有价值的宗教圣物。岛上的教堂得到了尊重和保护，岛上的居民也可以在三年内选择搬离罗德岛，但那些选择留在罗德岛的居民在五年内不用缴纳任何赋税。尽管最终没能守住自己的家园，可医院骑士团在罗德岛上的英勇表现还是让他们的声望更上层楼，当代大团长也被教皇赐予了“信仰守卫者”的称号。在随后的七年时间里，骑士团一直过着颠沛流离的日子，直到1530年神圣罗马帝国皇帝查理五世将马耳他岛，戈佐岛及的黎波里租与骑士团，每年只象征性地向骑士团征收一只马耳他鹰银币作为贡品（著名的“马耳他鹰协定”）。
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圣约翰骑士团的骑士们均来自欧洲最显赫的豪门望族，其任务就是守卫天主教信仰。
他们在马耳他的比尔古安定下来，加强了这座村镇的防卫力量，新建了一些建筑作为自己的管理处，还重修了古代堡垒马里斯堡，将其命名为圣安吉洛堡垒。修建了海军基地的骑士们再次对奥斯曼帝国造成了威胁。没过多久，苏莱曼大帝就决定侵略马耳他岛，摧毁骑士团的舰队。1565年，奥斯曼帝国的舰队袭击了马耳他，这场战争持续了三个月时间。在大团长让·帕里索·德·瓦莱特的领导下，骑士团取得了围城战的胜利。这场战争被称为“大围城战”。
在这场战役过后两百年，伏尔泰还就此写道：“没有什么事情能够比马耳他的大围攻更加为人所知。” 之所以会产生这一说法，其原因在于：1565年5月18日，奥斯曼帝国土耳其人及其盟友投入了48，000名他们的精锐部队攻击这些岛屿，意图侵占它们，然后通过西西里岛和意大利挺进南欧地区。为与之搏斗，岛上召集了8，000余名男丁，其中有540名马耳他骑士团成员及4，000余名马耳他本地平民，剩余部分则由西班牙与意大利的雇佣兵组成。由于登陆时未受到抵抗，土耳其人的首要目标是为他们的大型舰队寻找一块锚地。出于这一考虑，他们对圣埃尔莫发动了袭击。经过31天的英勇抵抗，该要塞在土耳其人的狂轰滥炸和持续进攻下沦陷。此后，奥斯曼土耳其人将他们的注意力又转向了两个俯瞰码头的具有极强防御工事的城镇——比尔古和森格莱（马耳他三姐妹城之一）。在接连遭受到轰炸并在坍塌的城墙受到强大攻击下，基督教部队克服了一切困难，未能让敌人得逞。直到大约8，000名增援部队从西西里赶来后，马耳他人才成功的驱赶走了土耳其人，同时也拯救了自己。
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“大围攻”时的马耳他要塞炮群
在大围城战之后，骑士团决心将马耳他建成一座适合军事骑士团的堡垒，拥有一个配得上骑士团盛名的城市。大团长瓦莱特（Valletta）是瓦莱塔市的奠基人，因此这座城市以他的姓氏而命名。继任的大团长们不断对城市进行投资，骑士团的舰队也成为了地中海实力最强的舰队之一。在1571年的勒班陀战役中，骑士团在击败奥斯曼帝国中发挥了作用。这是基督教世界取得的一场重大胜利。通过与欧洲君主及教廷的联系，骑士团在欧洲保持着巨大的影响力。
让·帕里索·德·拉·瓦莱特 (Jean Parisot de la Valette1495年2月4日－1568年8月21日)，法国贵族，1557年至1568年担任第49任马耳他骑士团大教长。
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两百年后，当拿破仑率领的法军于1789年包围了马耳他诸岛后将骑士们从岛上驱逐了出去。在多个意大利城市之间数次辗转后，骑士团成员最终在罗马稳定下来，成为了今日人们所熟知的马耳他骑士团。