单细胞测序方法和原理系列：
- 1. 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics
- 2. DNA文库构建和Illumina测序化学原理
- 3. 单细胞免疫组库：TCR基因重排原理和TCR测序建库方法
1. 与scATAC-seq有关的基本概念
ATAC-seq：是Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing的首字母缩写。ATAC-seq是一种捕获染色质可及性（染色质开放性）的测序方法。
scATAC-seq：是single cell ATAC-seq，也就是单细胞的染色质转座酶可及性的高通量分析。
染色质可及性：人的DNA链全部展开大约有2m，需要折叠为染色质结构才可以存储到放到细胞核中。染色质的基本结构单位是核小体（由组蛋白组成），核小体再折叠最终形成高度压缩的染色质结构。一般真核生物是这种方式来存储遗传信息。这个过程像我们将文件压缩为zip或者rar的压缩包，减少它的占用空间。高度折叠的染色质结构在复制和转录时需要暴露出DNA序列，这段暴露的区域就是染色质开发区域，这个区域可以供转录因子和其他调控元件结合，所以它与转录调控是密切相关的。这种致密的核小体结构被破坏后，启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件和反式作用因子可以接近的特性，叫染色质的可及性，也叫染色质开放性（chromatin accessibility ），这段区域叫开放染色质（open chromatin）。这个过程类似于我们要查看刚刚压缩包里的文件，我们需要解压后才能查看到文件里的内容。开放染色质的研究方法除了ATAC-seq，还有DNase-Seq，FAIRE-seq，MNase-seq 等。ATAC-Seq由于其所需样本少，建库快，重复性更高，是目前研究开放染色质的主流技术方法。
2. 原理
ATAC-seq原理：
利用转座酶Tn5可结合开放染色质的性质，使用Tn5酶捕获DNA序列，进而上机测序。
转座酶会携带特定的已知序列，然后将这些序列插入到开放的染色质区域中，最后将带有转座酶标记过的序列上机测序，通过软件计算，就能获得基因组哪些地方是开放的。
ATAC-seq技术限制：
1. Tn5通过插入剪断DNA 并将测序接头连接到剪断的两个DNA 片段的末端，因此对于一个DNA 片段而言，其两端的接头连接是随机的，这便导致同一片段两端的接头有50%的概率是同一接头。而只有连接不同接头的片段才可用于富集扩增及测序，因此，有一半的片段无法利用；
2. 大量剪断的DNA 由于片段过大，无法进行PCR富集;
3. Tn5 的活性受反应溶液的组成及反应条件影响，仍然需要优化以便提高剪切效果；
4. ATAC-seq在植物细胞中存在以下难点：细胞壁的存在，叶绿体、线粒体等细胞器的污染，缺少稳定遗传的细胞系;
scATAC-seq要解决的问题：
1. 通过转座酶对染色质的哪些位置的DNA进行切割，来分析紧密缠绕的染色质在哪些位置有松开。
2. 染色质松开的地方，一般也是转录因子容易接近染色质DNA的地方，也就是转录行为更多地发生的地方。
3. 哪些基因被转录，决定了一个细胞执行哪些基因功能，和这个细胞有哪些特征。
3. 实验方法
scATAC的实验过程分为以下几步：
1. 把目标组织样本解离成多个单细胞
2. 分散好的单细胞用10X的仪器处理，变成许多细胞、凝胶微珠和酶的混合液滴。这些微滴是油包水的乳浊液。
3. 带了DNA接头的转座酶和染色质中的DNA进行接触，染色质中缠绕的比较松的地方，DNA会裸露出来，裸露的DNA就容易和转座酶发生转座反应。
- 凝胶微珠
凝胶微珠上连着许多跟DNA标签链，一个微珠上的所有标签链的序列是一样的。标签链上的序列分为3段，P5这一段是将来能够与illumina测序芯片相结合、直接作用于测序的序列。10X barcode这一段序列，是针对这个微珠的序列，不同的微珠在这段序列是不一样的。也就是说这段序列是这个微珠的身份证号码，是唯一序列。将来高通量测序之后，可以通过这段序列把一个测序read回溯到原来的微珠。Read 1N是和转座酶连接的接头的互补序列。
- 把转座酶产生的片段转化成测序文库
转座酶与染色质DNA反应后，一方面会把DNA片段从染色质上切割下来，成为单独的小的DNA片段
同时会把转座酶上连的DNA接头连到DNA片段上。
凝胶微珠上连着DNA标签链的Read1N序列会与DNA片段上的接头序列互补，退火粘上。
在聚合酶的作用下，DNA片段就会延伸出10X Barcode序列和P5序列。
接着对这些DNA片段进行建库操作，就会得到能够适配illumina测序仪的测序文库。而且这些测序文库中都带了10X Barcode序列，在后面的生物信息分析中，每个read都可以通过10X Barcode序列回溯到原来特定的微珠。
3. CellRanger ATAC数据解读
做完测序后，就可以用cellranger ATAC软件进行分析。
3.1 开放区域鉴定
分析的第一步是做开放区域鉴定，也叫Cell Peak。就是把reads比对到参考基因组上之后，找出Fragments富集的地方。Fragments是指测序测到一个片段，也就是高通量测序中一对reads框出一段序列叫做一个fragment。哪个地方的Fragment数量多，就是peak。也就是图中显示的一个一个的尖峰。
在分析过程中，要去掉线粒体上的位置。一方面线粒体是没有组蛋白包裹的，是裸露的，很容易与转座酶起反应，另一方面线粒体的拷贝数比染色体DNA的拷贝数高许多，这也导致了线粒体上的Fragment数很高。所以分析过程中要去掉线粒体的Fragment。
3.2 对Cells和Non-cells的Fragments进行区分。
因为ATAC测序得到的Fragment很散，会对后面的分析形成很大的噪音。为了减少噪音，就要对哪些Fragment是可以算成是一个barcode内的，或者说一个细胞内的，另外哪些不能算成一个细胞内的，进行区分。区分的标准是一个barcode中含有多少个peak。
Barcode-Peaks图形
上图在200个peak的高度，曲线被一截为二。左上黄色是cells，也就是说这些barcode都聚合了较多的peak，对接下来的分析有意义，被作为细胞进行保留。右下蓝色是Non-cells，这些barcode聚合的peak较少，对接下来的分析没有意义，被舍弃。
区分理想与糟糕的Barcode-Peaks图形
注意：上图中的轴的数值都是log值，而不是线性值。因此左图有几千个barcode可以归为有效的cells，而右图只有不到100个barcodes可以归为有效的cells。
Barcode所包含的Fragments数与Barcodes关系图
可以看到有大量散在的fragment分散在大量的barcode中，比如只有一条fragment的barcode超过了10万个，这也说明了为什么要对barcode进行区分，因为散的，没几条fragment的barcode事实上占了相当大一部分，也就是图中蓝色的那一大片不能产生有效信息的fragment和barcode需要被去除掉。
区分理想与糟糕的Barcode-Peaks图形
分类图：从另一个角度说明cells和non-cells的区别
蓝色的点都位于右上方，也就是既要有足够的fragment，又要fragment有足够比例的落在peak上，这个barcode才能归类为cells。
区分理想与糟糕的分类图
3.3 对barcodes进行聚类
挑出了好的barcode之后，就会对这些barcodes进行降维和聚类。降维的方法是LSI方法（Latent Semantic Indexing，隐语义索引）。LSI降维后进行umap和tsne降维（输入的是lsi矩阵）。
scATACseq数据的稀疏性决定了它不能做PCA降维。因为稀疏性导致所有的0位置上的细胞间高度相似，所以需要使用分层降维方法。具体参考：ArchR降维分析
区分理想与糟糕的聚类结果
3.4 片段的长度分布
理想的片段长度分布图比较明显的特点是在略小于200bp处有一个峰，这个峰对应于转座酶一般会得到的片段长度。图中还可以看到每隔约10.5个bp就有一个小齿，这个小齿是对应于DNA螺旋转一周的间距。右图是糟糕的片段长度分布，它没有明显的峰，这也说明它失去了染色质的结构。
3.5 在转录起始位点（TSS）附近的富集
左图中，曲线的最高峰在转录起始位置偏上游约几十个BP的样子，因为转录因子就是从这里开始结合到DNA上，开始进行转录的，所以这里有一个尖峰是符合我们的预期的。而右图的纵坐标对应到最高峰是大约在2，说明右图的富集程度远远不如左图。
4. 生物信息分析报告解读
4.1 把细胞聚类成簇（根据每个细胞中的peak）
4.2 簇与簇之间的相关性
4.3 对簇进行GO分析
4.4 对簇进行KEGG富集分析
4.5 DisGenNet与疾病关联性的分析
DisGenNet是一个人类基因与疾病关系的数据库
4.6 Trajectory拟时轨迹分析
4.7 Co-accessibility共可接触性图
共可接触性是指两个peak往往在同一个细胞中出现，图中一段拱形练到两个peak，拱形的颜色越偏红，则被连接到的两个peak共性越强。
5. 小结
scATAC-seq可以提供丰富的染色质开放性信息
参考：
1. 【陈巍学基因】scATAC-seq实验方法与报告解读
2. 入门ATAC-seq，你需要知道什么？⚠️
3. 一文读懂染色质可及性及ATAC-seq