CRISPR、CRISPR screen以及与单细胞测序的结合

CRISPR

首先来介绍一些CRISPR，它首先在大肠杆菌中发现，全称为：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic  Repeats【成簇的有规律的间隔短回文重复】

结构：

CRISPR结构

1、repeat：short DNA ，20-40bp，Palindromic回文【DNA转录后，回文结构会形成发卡结构】

2、spacer DNA：间隔序列，将repeat间隔开【spacer DNA可以和病毒DNA 完美匹配，特别是噬菌体DNA】

3、cas：CRISPR-associated【与CRISPR相关的基因】

【cas蛋白具有解旋酶活性，可以将DNA链解旋，同时具有核酸酶活性，可以切割DNA链】==>>因此，这是细菌的一个免疫系统，通过这种方法，细菌可以抵抗其敌人：噬菌体

CRISPR cas在细菌中的工作原理

工具人：cas，切掉基因

因此：只要知道目标DNA 的序列，把它做成guide RNA，融合到cas蛋白上，就可以特异性的把这段序列切掉。

工具人：cas，插入新的基因

CRISPR screen

接下来，学习一下CRISPR技术的一个应用——CRISPR基因筛选

利用功能缺失的策略进行的高通量遗传筛选，是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。CRISPR基因筛选，可以通过 CRISPR gRNAs 靶向不同细胞中成百上千各异的基因，然后通过实验筛选编辑细胞，gRNA 可以帮助确定哪些基因对于生物学作用机制具有至关重要的作用。然而，这种筛选方法比较适用于回答与细胞生长能力直接相关的问题。

如果我们想研究基因调控和其它复杂的生物控制机制，就要明白多个基因是如何协同工作还有调控调节细胞状态。这就需要针对每个CRISPR靶向基因，分别进行培养，编辑和分析细胞。

这时候可以采用CRISPR + inDrop scRNA-seq

CRISPR上文讲过，他可以在特定位点敲除基因，进而观察细胞其他结果。

inDrop scDNA-seq，之前的一篇文章有讲解。他可以同时（一次实验），测出几千个细胞的转录组水平。

当这两种技术灵魂大互换之后，诞生除了一种新的技术：CROP-seq（CRISPR droplet sequencing，CRISPR液滴测序）

在此，引用一篇通俗易懂的文章，很赞！！！

现在我们发现了一个enhancer，他可能调控了某一个promoter，我们想看看到底是调控了哪个Gene的promoter，我们会怎么做？我们可能会想办法把这个enhancer ko掉，kockdown 或者overexpression，然后测序看看哪个gene的transcript发生了改变。

那么，如果你有了200个enhancer，你该怎么办呢？太麻烦了，有的人就想简单粗暴的一次性解决掉（哈哈，真是符合我的审美）。他们将所有200个enhancer当作target，针对这些target设计sgRNA，然后把他们混在一起，包装成慢病毒的库，一股脑的扔到你的细胞里面去。

听起来很爽，是一种快刀斩乱麻的思路。但是然后呢？我们怎么处理那一盘我们都不知道的转染了什么的细胞？这就到了single cell展现真正的技术的时候了。对于single cell的常规解法是用来分析细胞的异质性，找到linage发展的规律，但是有人说，这不够fancy，single cell还可以有更强大的功能。他们把他拿来做screen。对于我们刚刚一股脑转染的那一盘细胞，如果我们用来做Single Cell RNA-seq，我们就知道了每一个细胞的transcriptom，和control组比较，就知道了每个细胞的transcriptom发生的改变。

那如何知道我们对每个细胞施加的干预是什么呢？每个细胞里转进了几个guide RNA，每个guide是什么呢？很简单，给每一个guide加上一个barcode，然后让guide序列的插入位点接近mRNA的3‘端，根据Drop-seq的测序原理，就可以把连接着guide序列的sgRNA一起测到啦。

作者：致知_5974链接：https://www.jianshu.com/p/3d4de712b1c5

参考：

https://www.bilibili.com/video/BV15x411Z7kf?p=2

https://www.jianshu.com/p/cd402fc588af