如何鉴定数据的建库方式（链特异性或非链特异性）

来自SRA的转录组数据，很多文章方法描述简单，无法判断是否为链特异性数据，导致在mapping和raw reads count时参数不知如何选择。所以在数据处理前明确其建库方式尤为重要

什么是链特异性建库

在RNA-Seq建库的时候，第一步都是进行RNA到cDNA的反转录，在反转录以后，普通的RNA-Seq就直接使用random primer进行第2条链合成，随后加接头。这样构建出来的RNA-Seq库进行测序以后是分不清这个序列是来自于genome的那条链的，因为被测序的有可能是gene的foward strand也有可能是reverse strand。而链特异性的RNA-Seq建库是通过一定的建库策略，让RNA在反转录和加adapter的过程以后还能够保存链的信息的建库策略。
那么链特异性RNA-Seq的优势在于哪里呢？是在于它能够处理一些gene overlap比较复杂的情况。我们都知道，几乎所有高等生物的gene在genome中的分布都是非均匀的，而且一般都是没有链的偏好性。
如果是普通的RNA-Seq，是分不清这些overlap区域的reads到底来自于哪一个gene，这就给定表达量带来了非常大的麻烦。但是链特异性的RNA-Seq就不会，如果只是foward strand的gene表达那么reads就只会mapping到对应的链上。
所以，用链特异性的建库方法，是能够更加准确进行gene定量的。
至于链特异性建库的劣势，大概有2点吧：1个是贵，1个是操作复杂对于珍贵样品（比如人体组织样品）一旦建库不成功就game over了。

如何判断数据的建库方式

判断转录组数据是否为链特异性，可以用RSeQC的infer_experiment.py工具。
该软件的输入数据为bam文件及bed12文件，bam文件很好得到，但是对于bed12文件确实要下一些功夫了。该文件可以应用UCSC的gtfToGenePre工具获取，具体代码如下：

#安装gtfToGenePre
conda install -c bioconda ucsc-gtftogenepred
#从gtf转换为GenePred格式
gtfToGenePred -genePredExt -geneNameAsName2 ../../reference/homo/Homo_sapiens.GRCh38.104.gtf gene.tmp
#从GenePred文件提取信息得到bed12文件
awk '{print $2"\t"$4"\t"$5"\t"$1"\t0\t"$3"\t"$6"\t"$7"\t0\t"$8"\t"$9"\t"$10}' gene.tmp >  genes_refseq.bed12

得到bed12文件即可使用infer_experiment.py判断数据是否为链特异性。

#检验
infer_experiment.py -r genes_refseq.bed12 -i 2-mapping/SRR14760842.bam
 
##结果
This is PairEnd Data
Fraction of reads failed to determine: 0.1151
Fraction of reads explained by "1++,1--,2+-,2-+": 0.4451
Fraction of reads explained by "1+-,1-+,2++,2--": 0.4398

这个结果怎么看呢？
其实很简单，就是要看这里！

如果两种的比例接近1:1则是非链特异性，如果两者比例悬殊，则是链特异性。
举个例子：

上图这就是链特异性的单端数据

上图这种就是非链特异性的单端数据

对于双端测序则有些复杂：

上图这种显然是链特异性，而且是fr-secondstrand。意思就是read1在+链，相对的gene也同样在+链上，而read2在+链，相对的gene在-链上。这种就是kallisto中的--fr-stranded和stringtie中的--fr。

上图这种虽是链特异性，但是是“fr-firststrand”，也就是参数中的--rf。

上图这种两种都在0.5附近且比例接近1:1，是非链特异性的双端测序

结合上述例子，很显然鉴定结果很明确，我的数据是一个双端、非链特异性的数据，快检验一下你的数据吧！

参考

1. RSeQC判断链特异性（strand-specific）

2. 如何判断数据为链特异性转录组数据

3. Reference gene model in bed format

4. RSeQC使用笔记