2022-07-06

一、非洲猪瘟抗原检测流程

1.样品的制备：实验室老师提前准备了阳性质控，取30ul阳性质控加入270ul的生理盐水中，做10倍稀释，稀释4次。

2.制好的样品放入传递窗中。

3.配反应体系：

1份反应体系由10ulPCR扩增反应液+5ul实时荧光混合液+5ul模板组成

按16份配制，取160ulPCR反应液+80ul实时荧光混合液，涡旋混匀，按15ul/管分别装于PCR反应管中，盖上盖子转移至传递窗待用。

4.核酸提取：

（1）取出深孔板，颠倒混匀使磁珠重悬，轻甩板孔使试剂盒磁珠集中到孔板底部，使用前按住深孔板小心撕去封口膜。

（2）在第2列的8个孔中，加入100ul样品，100ul生理盐水，20ul蛋白酶K。

（3）将磁棒套插入32道自动核酸提仪磁棒套架卡槽内

（4）选择程序并运行，自动化程序结束后，将第6列的核酸样品取出，待用。

（5）在配制好的反应体系配制液里分别加入阴性对照5ul，样品各5ul，阳性对照5ul，盖好盖子，瞬时离心，转至传递窗待扩增。

（6）使用PCR仪器扩增出结果。

二、微生物实验

1、培养基制备

将培养基（50ml），均匀倒入3块一次性培养皿，做好标记。

2、平板划线（3区）

用烧灼后的接种环挑取营养琼脂上的单菌落，接种到营养琼脂、麦康凯平板，做好标记，37℃孵育18-24小时。

3、药敏实验

（1）菌悬液的配置

在生物安全柜操作，准备一只无菌西林瓶，加入1ml左右生理盐水，用接种环无菌挑取营养琼脂上的典型单菌落在瓶壁上研磨充分，使菌落与生理盐水充分混合

将制备的菌悬液用标准比浊管校正至0.5麦氏单位

（2）接种平板

用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁内旋转挤压，去除多余水分，用拭子均匀涂抹培养基表面，可多个角度涂抹使其涂抹均匀，最后在琼脂平板边缘涂抹一圈。

（3）贴药敏片与培养

用记号笔在培养皿背面做7个区分布，做好记号1-7

用无菌镊子夹取药敏片平放在琼脂并轻压使其紧贴于琼脂平板，每次夹取药敏片之前都需要灼烧一次镊子

将培养基放于温箱，37℃培养18-24小时，观察结果。