2022-07-06

非洲猪瘟检测流程要点

1、进入实验室按照要求穿好装备进入实验室，病原稀释及制备，将实验用假阳性按照倍数稀释，最高稀释到一万倍。所有操作流程都在生物安全柜进行，按照流程进行编号，编写检测编号。在每个实验室都要将白大褂以及手套进行更换。

2、到试剂准备区进行试剂准备，按照样品数量加阴阳对照进行配备，该项目在超净工作台进行。将制备好的试剂放入传递窗，进入核酸提取环节。

3、核酸提取区，进行核酸提纯，用磁吸法核酸提取试剂盒进行提取，按照步骤加入相应提取试剂进行提纯，核酸提取仪程序可以按照检测的样板以及样品数量进行设定，工作量不大或者组织器官尽量采用慢提。在添加试剂的时候应该注意8道移液枪的试剂是否全部打进提纯盒，提纯完成后，在该实验室继续进行我们的试剂进入下一步扩增环节，通过传递窗送到核酸扩增室进行下一步工作。核酸提取仪提取完成后进行消毒工作，紫外线灯消毒30-60分钟。

4、核酸扩增按照试剂盒设定程序进行扩增，检测完毕后进行读数，并且进行记录。

平板制备及药敏试验

1、按照要求配备好两组培养基，营养培养基及麦康凯培养基，培养基制备按照要求制备，营养琼脂培养基制备时在制备培养皿时放在50℃水浴锅进行保温防止凝固，在倒培养基时应该注意摇匀幅度不能太大防止有气泡导致培养基也有气泡孔，每个培养皿预计20ml左右培养液大概厚度在4mm，完成后生物安全柜室温放置让其凝固。

2、平板划线注意事项：从无色的的培养基中取适量的按照培养皿进行分区，第一区划线按照面积的1/4的面积进行划线。第二区连续划线与第一区最后一条线交接，连续交接不超过4次，按照同样方法依次划3区，放置37℃恒温培养箱进行培养8到12小时。

一切作业在生物安全柜进行，划线时快速准确，打开培养皿盖时间尽量短。

接种时应该手握笔姿势，120°倾斜角，轻轻划线。

之字形划线，相邻两线不要有重复

接种环在取菌前要进行高温杀菌，第一次划线跟第二次划线都要进行灼烧，完成接种后也要进行灼烧灭菌。

药敏试验

操作流程：抗生素选择--培养基选择——菌悬液制备——平板涂布——贴药敏片与培养——结果观察及判定

注意事项：

菌悬液，采用纯化后单菌落或菌台，用接种环挑取菌落进行瓶壁研磨充分，使得与生理盐水充分混合，在与比浊管进行比对，0.5-1之间比较适合。

平板涂布：

用无菌试子蘸取菌液，在瓶壁旋转挤压，去除多余菌液均匀涂抹在培养基表面，完成后将琼脂平板边缘涂抹一圈。

贴药敏片与培养

平板按照药敏片进行分区，每个区域中间放置一个不同的药敏片，贴好标记培养皿，37度培养20-24小时。