总结
前列腺癌从腺体到神经内分泌的谱系转变已经成为靶向治疗耐药的一种机制。确定直接的分子驱动因素并发展药理学策略，使用临床级抑制剂来克服谱系转换诱导的治疗耐药是当务之急。在这里，我们使用单细胞多组学分析，从107,201细胞中研究了细胞异质性、转录组调控和微环境因素的动态变化，这些细胞来自基因工程小鼠前列腺癌样本，这些样本具有患者肿瘤演变的完整时间序列。我们发现FOXA2协调前列腺癌从腺到神经内分泌的谱系转变，并且FOXA2的表达显著地被雄激素剥夺诱导。此外，Foxa2基因敲除可以逆转腺体到神经内分泌的转变。KIT通路受FOXA2直接调控，在神经内分泌前列腺癌(NEPC)中被特异性激活。药物抑制KIT通路显著抑制小鼠和人NEPC肿瘤的生长。这些发现表明FOXA2促进了前列腺癌中腺到神经内分泌谱系的可塑性，并为抗去势的NEPC提供了一种潜在的药理学策略。
亮点
单细胞多组学解释前列腺癌谱系可塑性
FOXA2驱动神经内分泌前列腺癌(NEPC)谱系可塑性
FOXA2直接促进Kit表达，进而维持NEPC细胞增殖
药理抑制KIT抑制NEPC肿瘤生长
介绍
细胞谱系可塑性被认为是肿瘤进展和治疗耐药的新机制。在分别应用了涉及AR抑制和酪氨酸激酶抑制剂的分子靶向治疗后，前列腺癌(PCa)和肺腺癌中发现了典型的腺到神经内分泌谱系的转变。然而，从头开始和靶向治疗相关的谱系可塑性的动态在很大程度上是未知的。系统地表征腺到神经内分泌谱系的转变过程可能会揭示潜在的分子细节，并刺激新的靶向治疗的发展，以防止或逆转耐药性。
虽然遗传和表观遗传学改变，如肿瘤抑制基因(PTEN、TP53和RB1)功能丧失，特异性转录因子(TF)的激活(N-MYC,SOX2, BRN2, and ONECUT2)，以及染色质重塑复合体的调节已被确定为前列腺癌谱系可塑性的潜在调节因子，但推动前列腺癌谱系可塑性的可药用靶点仍然不可用。这些研究强调需要系统地描述患者在整个时间序列中看到的肿瘤演变，并确定新的可用药靶点。
在单细胞水平上对基因表达、染色质调控图景和微环境因素的系统表征可能提供对前列腺癌谱系可塑性的基本了解，并导致识别潜在的可用药靶点。整合的单细胞图谱：同一细胞内的rna测序(scrna-seq)和转座酶可及染色质测序的单细胞分析(scatac-seq)有可能准确地重建组织发育的分子过程以及细胞谱系的可塑性。在这里，我们成功地建立了一个小鼠谱系追踪模型，以概括患者从腔到神经内分泌的谱系转变。对107,201细胞的单细胞多重组学(scRNAseq和scATAC-seq)分析表明，主要转录因子FOXA2和FOXA1协调前列腺癌从管腔到神经内分泌的谱系转变，确定了神经内分泌前列腺癌(neuroen-docrine prostate cancer，NEPC)中激活的KIT信号通路，并提示KIT是克服NEPC治疗耐药的潜在靶点。
单细胞多组学揭示前列腺癌谱系可塑性的景观
NEPC从PCa克隆而来，伴随着从管腔癌细胞到神经内分泌癌细胞的表型转变。鉴于基因组改变的重叠提供的证据，例如TMPRSS2-ERG融合，以及谱系追踪表明管腔来源的PCA细胞可以形成NEPC。探索腔-神经内分泌分化的机制将具有极其重要的意义。我们建立了Pten，Trp53，一个由管腔细胞特异性诱导Tmprss2CreERT2驱动的Rb1缺失的小鼠模型，正如先前报道的那样。基于这一构建策略，我们将tdTomato置于内源Chga启动子的转录调控下，并且位于Lox-SToP-Lox（LSL）盒的下游。此后，该小鼠模型被称为TPPRC (Tmprss2CreERT2/+; Ptenflox/flox;Trp53flox/flox; Rb1flox/flox;ChgaLSL-tdTomato/+)并被用于确定NEPC的腔细胞来源，并通过tdTomato的表达直接指示神经内分泌分化。
为了表征前列腺癌谱系的可塑性，我们对服用他莫西芬（一种抗雌激素）后2周至6个月的TPPRC小鼠的前列腺癌进行了时间序列分析(图S1C)。SYP+/tdTomato+神经内分泌癌细胞在他莫昔芬给药后1个月出现，随着时间的推移，神经内分泌癌细胞的百分比逐渐增加，正如预期的那样(图1A)。值得注意的是，tdTomato的表达适用于准确地指示神经内分泌的差异，其与SYP的同时表达证明了这一点(图1A)。此外，我们观察到没有基底样分化(图1A)，这表明基底细胞或基底样细胞并不直接参与TPPRC小鼠的癌症进展。
为了系统地描述NEPC的暂时性进化，我们对从前列腺肿瘤分离的所有细胞进行了单细胞多组学测序分析，这些细胞在不同的癌症进展阶段具有独立的重复(图1B和S1D)，从而实现了在同一单个细胞中染色质可及性和基因表达的联合分析(图1C)。我们鉴定出107,201个通过过滤器的高质量细胞，这些细胞平均具有2,551个RNA特征和10,100个独特的ATAC-seq片段(图S1E and S1F)。为了排除技术批处理效应，我们合并了来自所有样本的数据集，并分别对scRNA-seq和scATAC-seq数据应用Seurat锚点集成和Harmony方法(Hao等人，2021;Korsunsky等人，2019)。我们进行加权最近邻分析(WNN)来整合RNA表达和染色质可及性数据，得到13个不同谱系的簇，主要包括前列腺上皮细胞、精囊细胞、间充质细胞、内皮细胞、免疫细胞和神经元(图1D)。然后我们将这些结果投影到RNAseq和ATAC-seq上，发现这两个投影之间有广泛的一致性(图1D)。此外，我们将这些结果按癌症进展阶段进行了分离，得到了大体相似的细胞分布模式，以排除批处理效应的干扰，而不考虑由于不同癌症阶段而导致的细胞组成差异(图S1G)。所有的细胞簇都通过具有代表性的谱系标记的RNA表达和染色质可及性进行区分(图1E-1H)。对于前列腺上皮腔室内的细胞，除了Krt8+管腔细胞和Krt5+基底细胞外，我们还根据神经内分泌基因的RNA表达和染色质可及性(图S2A-S2C)，如Chga、Insm1、Ascl1、and Sox2，根据较高的NEPC签名评分确定了神经内分泌细胞(图S2D-S2G)。与免疫荧光结果一致，神经内分泌细胞逐渐占据前列腺上皮腔室的大部分，同时腔内细胞相应减少，表现为管腔向神经内分泌转变(图S1G)。因此，我们构建了NEPC进展的单细胞多组学图景，为阐明谱系转换的分子机制和提出治疗方法提供了强有力的资源。
解剖细胞多样性和识别前列腺癌谱系可塑性的先驱力量
为了探究前列腺肿瘤细胞的细胞异质性，我们根据RNA表达和染色质可及性分别提取了管腔细胞和神经内分泌细胞进行分群，得到了5个不同的簇(图2A)。Ar和Chga的RNA表达模式表明簇1和簇2具有管腔来源，而簇3、簇4和簇5属于神经内分泌谱系(图2B和2C)，与肿瘤发生过程中细胞组成的变化一致(图2D)。对簇1和簇2中高表达的基因进行路径富集分析，发现了前列腺癌中与上皮分化和形态发生相关的通路以及典型酪氨酸激酶信号通路，反映了管腔癌细胞的特征(图2E和2F)。与簇3、簇4和簇5中Chga的特异RNA表达一致，这三个簇的特征与神经元发育和功能相关的生物学过程(图2E和2F)。有趣的是，簇3表现出高度增殖特性，这表明细胞周期基因如Cenpf、Top2a和Mki67的表达水平显著升高(图2E和2F)。因为细胞周期会干扰单细胞技术获得的聚类结果(Buettner et al, 2015;Luecken and Theis, 2019)的研究中，我们进一步通过应用细胞周期评分回归和细胞周期基因去除两种计算方法，进一步明确了细胞多样性是否主要归因于细胞周期。两种方法均观察到相似的分布模式，支持第3簇的真实增殖特征(图S3A和S3B)。此外，簇5中的神经内分泌细胞为Ascl1low或Ascl1-，以及高表达的Nfib和Sox6(图2E, 2G, 2H)。根据它们的谱系和标记，簇1、2、3、4和5分别被称为Arhigh前列腺癌- t (ARPC-T) (Tff3)、ARPC-C (Clu)、NEPC-M (Mki67)、NEPC-A (Ascl1)和NEPC-N (Nfib)细胞(图2G和2H)。免疫荧光分析也显示存在SYP+/KI67+ NEPC-M cells,SYP+/ASCL1high NEPC-A cells, and SYP+/ASCL1low NEPC-N cells (Figure 2I).有趣的是，我们观察到NEPC-A细胞和NEPC-N细胞集中但分离的空间分布模式，这可能表明了它们的最终分化状态(图2I)。
接下来，我们分析了来自6名去雄抵抗性前列腺癌患者的公开的scRNA-seq数据(Dong等人，2020年)。为了精确识别神经内分泌细胞，我们为每个细胞指定了NEPC评分，有796个特征基因在先前报道的两个队列的NEPC细胞中高度表达(表S1)。我们将这些scRNA-seq数据和标注在簇0、3、4、8和10中的细胞整合为前列腺上皮细胞(图S3C和S3D)。其中，簇4、簇8和簇10的特征是神经内分泌细胞，这从它们较高的NEPC评分中可以看出(图S3E)。我们提取了这些细胞来探索人类NEPC的细胞异质性，产生了三种不同的细胞亚型(图S3F)。为了评估人类和小鼠NEPC细胞多样性的一致性，我们计算了这三种人类神经内分泌细胞类型的小鼠集群特异性评分，在此基础上我们将集群1注释为NEPC- m样细胞，集群2注释为NEPC- a样细胞，集群0注释为NEPC- n样细胞(图S3G-S3L)。由于NEPC- a细胞和NEPC- n细胞表现出独立的分布模式，我们进一步试图基于bulkRNA表达数据确定是否可以在公开的NEPC队列中直接观察到这种细胞异质性(Labrecque等人，2019年)。我们观察到ASCL1high和ASCL1low细胞的清晰分离，如主成分分析(PCA)所示(图S3N)。与我们小鼠模型的结果一致，与ASCL1high细胞相比，ASCL1low细胞表现出更高的NFIB表达水平(Figures S3O–S3Q). 对来自5名个体患者的NEPC样本进行KI67、ASCL1和SYP免疫荧光染色，结果显示，在人类NEPC样本中，三种神经内分泌细胞类型普遍存在(图S3R和表S6)。因此，我们在一个与人类NEPC相对应的小鼠模型中发现了NEPC进展过程中的细胞异质性。
NEPC进展轨迹的解释确定FOXA2是一个谱系先驱转录因子
我们进一步试图描绘细胞分化轨迹。我们描述了伪时间早期的ARPC-T细胞和ARPC-C细胞，伪时间晚期的NEPC-M、NEPC-A和NEPC-N细胞(图3A)。伪时间分析的结果被证明是可靠和合理的，因为它们通常与真实的癌症进展阶段相吻合(图3B和3C)。接下来我们探讨了分化的轨迹，有趣的是，这导致两个分化谱系在早期共享相同的轨迹，但以两个不同的细胞群结束(图3D-3F)。这些结果表明，NEPC-A和NEPC-N细胞处于癌症进展的最终分化阶段。与谱系1和谱系2在早期发展阶段共享相同的轨迹一致，这两个分化谱系共享大部分动态变化的峰值，尽管在最终发展阶段有一些谱系特异性的峰值(图3G)。此外，基因表达的动态也表现出一致的模式(图3H)。
为了识别在癌症发展的不同阶段活跃的谱系特异性tf，我们进行了motif富集分析，同时考虑这些tf的基因表达。结果，Foxa1和AP1家族成员(Fosl2, Junb, Atf3, Fosl1和Jun)被证明是早期腔内前列腺癌的谱系先驱TF(图3I-3K)。有趣的是，除了先前报道的有助于NEPC分化的因子Sox2 (Mu等人，2017)，我们发现Foxa2在NEPC进展后期表现出了作为谱系先驱因子的突出潜力(图3L-3N)。
我们还应用了另外两种分析方法来识别谱系先驱tf。根据NEPC评分回归设计了两种方法中的一种。简而言之，根据本研究定义的NEPC特征基因(表S1)，我们确定了每个细胞的NEPC评分(图S4A)，然后进行Pearson相关，评估染色质可及性与NEPC评分之间的关系。通过这种方法，我们定义了530个与NEPC评分显著正相关的染色质可达性对应的峰，611个与NEPC评分负相关的峰(图S4B - S4D)。我们接下来使用dbtoolkit进行motif富集分析，并证明FOXA2倾向于结合神经内分泌癌细胞中的染色质可及性(图S4E)，而FOXA1表现出相反的潜力(图S4F)。另一种方法是使用SCENIC (Aibar等，2017)构建调节网络，在NEPC进展的不同阶段识别五个分簇中的每个tf，从而得出一致的结果，FOXA2表现为神经内分泌谱系的先驱TF，而FOXA1更倾向于调节腔系(图S4G-S4H)。一般来说，FOXA2+细胞的百分比随着癌症的进展而增加，scRNA-seq和免疫荧光都显示了这一点，伴随着FOXA1+细胞百分比的逐渐下降(图3O)。
我们根据bulkRNA表达对三个人类NEPC队列进行了查询(Beltran等，2016;Kumar等，2016;Labrecque等人，2019)的研究结果显示，人类NEPC的FOXA2表达水平明显高于ARPC(图3P-3R)。我们还对从多种人类前列腺癌类型中获得的两个公开scRNA-seq数据进行了综合分析(Chen等人，2021;Dong等人，2020年)，包括ARPC和NEPC。与小鼠模型的结果一致，FOXA2在神经内分泌癌细胞中唯一表达，而FOXA1在管腔癌细胞中高表达(图3S-3U)。
我们的研究结果表明Foxa2在神经内分泌分化中是一个谱系先驱TF，在RNA表达和motif活性方面与Foxa1呈负相关。
FOXA2调节前列腺癌细胞神经内分泌分化程序
根据我们的观察，我们假设Foxa1和Foxa2之间的平衡可能控制前列腺癌的谱系转换。为了描述FOXA1和FOXA2的全基因组顺反子，我们分别在NEPC进展的早期(给它莫西芬药2周后)和晚期(给它莫西芬药6个月后)对新鲜分离的前列腺肿瘤细胞进行FOXA1和FOXA2染色质免疫沉淀，然后进行测序(ChIP-seq)。与单细胞多组学的推论结果一致，在NEPC进展过程中，FOXA2的DNA结合活性显著增加(图4A)。相应的，FOXA1除了结合位点数量减少外(表S2, S3, S4, S5)， FOXA1的DNA结合活性普遍下降(图4B)。
我们接下来调查了FOXA2驱动的顺反子与前列腺癌谱系转移之间的全局关联。基于scRNA-seq数据中的28,407个前列腺癌细胞，我们对Foxa2及其靶基因的表达水平进行Pearson相关分析(图S5A)，这属于已定义的NEPC或ARPC签名(表S1)。因此，我们发现了305个直接与FOXA2结合的NEPC特征基因，如Syt1，它倾向于被FOXA2正调控。同时，97个ARPC签名基因，如Trim36，可能受到FOXA2的负调控(图4C)。这些结果表明FOXA2优先促进神经内分泌分化，抑制腔系分化。与之前的研究结果一致的是，FOXA1是AR的辅助因子，并促进管腔分化，我们还发现Foxa1的表达水平与ARPC特征基因的表达水平呈正相关，如Fkbp5，与NEPC特征基因的表达水平呈负相关，如Sox2(图4D)。
尽管FOXA1和FOXA2调控顺反子的基因组分布模式大致相似(图S5B)，并与之前报道的结果一致，表现出对内含子和远端基因间区域的结合偏好，我们发现只有11,288个结合位点被FOXA1和FOXA2共同占据(重叠)，42,467个结合位点(FOXA1特异性)和22,100个结合位点(FOXA2特异性)分别被FOXA1和FOXA2唯一结合(图4E、4F和4H)。这些结果与FOXA1和FOXA2在调节前列腺癌谱系可塑性方面的不同作用相一致。
为了确定FOXA1和FOXA2的结合是否与染色质状态相关，我们接下来对NEPC进展早期(第2周)或晚期(第6月)新分离的上皮肿瘤细胞进行了ATAC-seq分析。值得注意的是，与早期相比，在后期FOXA1所占染色质的可达性降低，而FOXA2所占染色质的可达性显著增加(图4F和4G)。这些发现表明FOXA2通过重塑染色质进行招募其他的TF，进一步促使我们研究哪些tf有助于促进神经内分泌分化。Motif富集分析发现，与神经发育相关的Sox10和MyoG是FOXA2特异性结合位点上排名最高的tf，暗示FOXA2在神经内分泌细胞分化中的谱系先驱作用(图S5C)。FOXA1特异性结合位点往往被与前列腺上皮分化相关的tf所占据，如Ar和Hoxb13(图S5D)。由于FOXA1和FOXA2的共同占据，与管腔和神经分化相关的tf在重叠结合位点富集(图S5E)。有趣的是，对于重叠的结合位点，最显著的基序序列与FOXA1和FOXA2略有不同，这可能与启动子区域的基因组分布扩大有关(图S5B)。总的来说，FOXA2驱动神经内分泌分化程序，并与染色质重塑功能相关。
雄激素剥夺促进FOXA2的表达和结合活性
NEPC主要发生于使用AR途径抑制剂治疗后复发的PCa，除了罕见的新发NEPC。接下来，我们怀疑FOXA2的表达和结合活性是否受到AR抑制的调节，AR抑制反过来又促进神经内分泌分化。为此，我们从注射他莫昔芬后1个月开始对TPPRC小鼠进行雄激素剥夺治疗(ADT：去势和苯扎鲁胺治疗castration and enzalutamide treatment)(图5A)。组织学分析表明，ADT促进Foxa2的表达，同时明显增加神经内分泌分化(图5B-5D)。利用ATAC-SEQ和RNA-SEQ系统研究ADT对FOXA1和FOXA2全基因组调控顺反子的影响。值得注意的是，ADT全局增加了FOXA2的DNA结合活性(图5E)，表现为FOXA2在Syt1位点的结合强度增强(图5F)，而FOXA1的DNA结合活性降低(图5G)。例如，一个已知的FOXA1靶基因Fkbp5与FOXA1的结合强度显著降低(图5H)。RNA-seq一致地表明，ADT显著增加Foxa2和NEPC特征基因的表达，如Chga, Syp, Syt1(作为FOXA2靶基因)(图5I-5K)，而降低ARPC特征基因，如Fkbp5(作为FOXA1靶基因)(图5L)。基因集富集分析(GSEA)还表明，ADT显著促进NEPC表型，抑制ARPC表型(图5M)。
这些结果表明，随着神经内分泌分化程度的增加，ADT促进FOXA2的表达和结合活性，而FOXA1则相反。这些结果揭示了FOXA2在ADT促进神经内分泌分化中的重要作用。
FOXA2基因敲除诱导腺-神经内分泌谱系转换逆转
在证明FOXA2编排神经内分泌程序后，我们接下来试图验证Foxa2基因敲除是否诱导腺到神经内分泌谱系转移的逆转。我们从6个月的TPPRC肿瘤(它莫西芬（一种抗雌激素）后6个月，NEPC肿瘤分期)新鲜分离的神经内分泌肿瘤细胞(图6A)中敲降Foxa2，并将这些细胞移植到SCID小鼠的肾被膜下。
与对照组肿瘤中明显的NEPC表型不同，Foxa2基因敲除的肿瘤明显表现为NEPC表型减弱和ARPC表型增强，免疫荧光分析(图6B)和qRT-PCR(图6C)均显示AR表达增加和SYP表达降低。此外，我们还进行了RNA-SEQ，以探讨Foxa2基因敲除对谱系可塑性的影响。PCA显示，Foxa2基因敲除显著改变了神经内分泌肿瘤细胞的转录模式(图6D和6E)。接下来，我们进行了基因集变异分析(GSVA)，以确定对照肿瘤和shFoxa2肿瘤中的NEPC和ARPC评分，并观察到Foxa2基因敲除抑制了NEPC表型，而促进了ARPC表型(图6F)。RNA-seq还显示，Foxa2基因敲除显著下调了Syp and Chga的表达，而相应地上调了Ar and Fkbp5的表达(图6G)。这些结果表明，FOXA2基因敲除导致了腺到神经内分泌谱系转变的逆转，证实了FOXA2在NEPC进展中的重要作用。
FOXA2促进Kit表达，Kit承担神经内分泌细胞特异性通讯
鉴于我们已确定FOXA2是调节神经内分泌细胞分化的先驱因子，接下来我们将探索FOXA2参与的生物学过程。除了神经元分化和上皮发育外，通过通路富集分析还发现了上皮细胞的增殖(图7A和S5F)。我们根据皮尔逊相关性分析确定的相关系数对这条途径中的基因进行排序，以评估它们的表达和Foxa2表达之间的相关性，从而确定Kit是一个高度相关的基因(图7B-7D)。ScRNA-seq清楚地显示Kit在神经内分泌癌细胞中高表达，而不是管腔癌细胞(图7E)。为了验证FOXA2调节Kit表达，我们在NEPC细胞(刚从6个月的TPPRC前列腺癌细胞中分离出来)中敲除Foxa2，导致Kit表达显著降低(图7F和7G)。
Kit基因编码c-KIT，主要被一种分泌型生长因子，干细胞因子(Kitl编码)激活，以进一步介导细胞内信号转导。因此，通过可溶性因子和膜结合受体的信号交互对于调节不同的生物过程至关重要，包括细胞的生长或死亡、迁移和分化。
为了在全球范围内探索NEPC中的细胞间通信，我们基于三种主要通信类型计算了细胞类型对之间的相互作用强度：分泌信号、细胞外基质(ECM)受体和细胞-细胞接触(图S6A和S6B)。我们观察到，传出信号(将细胞视为发送者)主要由间充质细胞、内皮细胞和神经元等基质细胞发出，反映了它们同时激活多个信号通路以支持上皮生长和分化的能力(图S6C和S6D)。有趣的是，我们发现了在不同细胞类型之间的传入通信(将细胞视为接收者)的总强度中的差异；例如，与腔细胞相比，神经内分泌细胞通过接收信号与其他类型的细胞进行交流的潜力通常较低(图S6D)。在这些发现的支持下，我们接下来调查了所有细胞类型的交流模式。对于传入通信，我们确定了六种不同的模式，它们通常与细胞谱系一致(图7H、S6E和S6F)。例如，免疫细胞的传入通信以模式4为特征，它代表了多条与免疫相关的通路，包括但不限于CCL1、IL1和TNF，这表明许多公认的信号事件得到了忠实的恢复(图7H和7I)。我们还调查了传出通信，并观察到了与传入通信所观察到的模式类似的模式(图S6G-S6J)。这些结果暗示了细胞间通讯的谱系特异性，这可能与谱系特有的功能有关。
有趣的是，尽管腔细胞、基底细胞、甚至精囊细胞之间的两种通信方式大致相似，但神经内分泌细胞具有不同的传入通信模式(图7H、S6E和S6F)和传出通信模式(图S6G-S6J)。基于这些发现，我们接下来专注于识别神经内分泌特异性的传入通讯，从而识别出七条信号通路。其中，KIT通路表现出最丰富的信号相互作用(图7J)，与其在我们发现的介导NEPC增殖的突出作用(图7B)一致。通过具体检查KIT途径的信息流，我们观察到神经内分泌细胞是接收KIT配体KITL的主要目标，KITL由不同类型的细胞共同分泌(图7K-7M)。与此结果一致的是，Kit仅在神经内分泌细胞中显著表达，而Kitl在包括神经内分泌细胞在内的多种细胞中大量表达(图7N-7P)。这些结果表明，神经内分泌特异性KIT途径以自分泌和旁分泌两种方式发挥作用。总的来说，对细胞间相互作用的系统表征揭示了KIT通路在神经内分泌细胞中被特异性激活，再次强调了KIT在促进NEPC进展中的潜在作用。
抑制KIT通路为NEPC提供了潜在的治疗途径
接下来，我们试图确定Kit的基因沉默是否抑制了NEPC细胞的生长。我们拆卸了从6月龄TPPRC肿瘤新鲜分离的小鼠NEPC细胞中的Kit，并将它们移植到SCID小鼠身上。KIT基因敲除显著抑制了NEPC肿瘤的生长，验证了KIT在维持NEPC细胞增殖方面的重要作用(图8A-8C)。伊马替尼Imatinib(也被称为‘’Gleevec‘’或‘’Glivec‘’)是一种酪氨酸激酶抑制剂，目前是国家综合癌症网络临床实践指南中唯一推荐的针对黑色素瘤KIT突变的药物，这使我们研究了伊马替尼对NEPC进展的功能后果。值得注意的是，伊马替尼在体内显著抑制了NEPC肿瘤的生长，而苯扎鲁胺如预期的那样显示出不显著的作用(图8D)。我们还评估了其他KIT抑制剂，包括索拉非尼sorafenib、舒尼替尼sunitinib和卡波赞替cabozantinib对NEPC细胞生长的影响。与伊马替尼的抑制作用一致，这些KIT抑制剂在体内和体外也显著抑制NEPC细胞的生长(图8D和S7A-S7F)。这些结果表明，对KIT通路的药物抑制也抑制了小鼠NEPC的进展。
这些对小鼠NEPC的观察促使我们确定KIT是否在人类NEPC中发挥这样的功能。与ARPC样本相比，NEPC样本在三个人类NEPC队列中显示出更高的KIT表达水平(图8E-8J)。此外，基于人类CRPC队列(Abida等人，2019年)，KIT表达与NEPC评分及SYP、ENO2、EZH2表达呈正相关(图S8A)，与ARPC评分及ARPC签名基因表达呈负相关(图S8B)。一致地，高Kit的癌症更有可能具有神经内分泌特征(图8K、S8C和S8D)。我们进一步研究了KIT在我们小组先前建立的多个人类前列腺癌组织中的表达(Gao等人，2014)，发现与其他类型的前列腺癌组织相比，NEPC细胞系KIT的表达水平较高(图S8E)。这些结果也通过分析一个公开可用的RNA-SEQ数据集得到了验证，该数据集主要基于经典的人类前列腺癌细胞系(图S8F)(Park等人，2018年)。
为了研究KIT抑制剂是否可以抑制人NEPC细胞的生长，我们用四种KIT抑制剂处理MSKPCa10(ST88)和PM154，这是我们小组以前建立的两个具有良好特征的人NEPC类器官细胞系(Gao等人，2014)。我们发现，这些抑制剂显著抑制MSKPCa10和PM154的生长，而苯扎鲁胺几乎没有起到预期的作用(图8L和8M)。我们还对人NEPC类器官、MSKPCa10和PM154进行了Kit敲除。QRT-PCR显示在MSKPCa10和PM154中都有Kit敲除(图S8G和S8H)。与KIT在小鼠NEPC肿瘤生长中的重要作用一致，在MSKPCa10和PM154中KIT被敲除后显著抑制了它们的生长(图S8G和S8H)。
通过体外器官系统和体内同种异体移植实验，我们证明了KIT通路的基因沉默和药物抑制都能抑制小鼠和人NEPC的生长，提示KIT靶向治疗NEPC是一种潜在的治疗方法。
讨论
新的证据表明，谱系可塑性在癌症进展和对分子靶向治疗的耐药性中起着重要作用。主要的转录因子被认为是调节细胞命运重新编程的关键驱动因素。通过对人PCa和NEPC样本的典型快照比较，许多TF与PCa谱系可塑性的获得有关，如BRN2, N-Myc, ONECUT2, REST, and FOXA1 R219 mutants。然而，从头开始和靶向治疗相关的前列腺癌谱系可塑性都是高度动态的，这可能阻碍对前列腺癌从管腔向神经内分泌转化的先驱驱动因素的准确阐明。在这里，通过单细胞多组学图谱，我们表征了107,201前列腺癌细胞的基因表达和染色质调控图景，以及患者肿瘤演变的完整时间序列，并确定先驱TF FOXA2直接驱动前列腺癌从管腔到神经内分泌的转变。尽管通过几项重要研究，FOXA2已被认为是神经内分泌分化的潜在调节因子以及一种特异的神经内分泌标记物，我们的工作从三个方面加强了对FOXA2在前列腺癌中作用的理解：(1)我们通过单细胞多组学、RNA-seq、ChIPseq和ATAC-seq等方法系统地探讨了FOXA2调控前列腺癌谱系可塑性的分子机制；(2)我们发现FOXA2直接与Kit基因座结合，并促进Kit在NEPC中的特异表达；(3)重要的是，我们证明了Kit通路的临床级药理抑制物可为NEPC提供潜在的治疗途径。
几乎没有报道的前列腺癌谱系可塑性的驱动因素目前作为药理靶点是可行的。在这里，我们发现先驱者TF FOXA2直接增加神经内分泌细胞Kit的表达，肿瘤微环境细胞表达Kitl与神经内分泌细胞积极交互。值得注意的是，伊马替尼、索拉非尼和舒尼替尼是美国食品和药物管理局批准的用于KIT抑制的药物。伊马替尼治疗KIT驱动的胃肠道肿瘤和黑色素瘤的临床成功是否会转化为NEPC治疗，值得研究。尽管先前伊马替尼治疗前列腺癌的临床试验结果令人失望.这些临床试验都没有在KIT高表达和NEPC特征的患者中进行专门评估。在这里，使用患者来源的抗去势NEPC和小鼠NEPC类器官模型，我们证明了KIT药理抑制剂使NEPC治疗敏感性有效。
值得注意的是，TPPRC的肿瘤启动是由Pten、Trp53和Rb1的三重敲除驱动的，如前所述，这是从头开始对ADT耐药(Ku等人，2017)。尽管我们观察到在Foxa2基因敲除后，TPPRC肿瘤中Ar的表达增加，但由于其从头开始对ADT的耐药性，TPPRC模型可能不适合验证ADT的治疗反应。进一步研究开发新的前列腺癌模型并探索FOXA2与ADT治疗反应的关系将拓宽对FOXA2在前列腺癌中作用的理解。
我们的研究提供了前列腺癌从管腔到神经内分泌谱系转变的高分辨率转录和染色质可及性图谱，揭示了FOXA2和FOXA1在介导前列腺癌从管腔到神经内分泌谱系转变和KIT信号激活中的关键作用，并强调KIT信号作为NEPC潜在的治疗靶点。