单细胞转录组|Seurat 4.0 使用指南

后台有读者翻到了一年前发的文献解读，请教了一下文章的图的做法。正好前段时间刚做过单细胞转录组分析，今天就给大家介绍一下常用工具Seurat的用法。

Seurat 4.0 使用指南

设置Seurat对象

示例数据

10X Genomics免费提供的外周血单核细胞(PBMC)数据集。通过Illumina NextSeq 500测序的2700个单细胞。示例数据下载:https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz。(或者后台回复seurat,领取完整代码及示例数据)

setwd(".../filtered_gene_bc_matrices/hg19") #设置工作环境到数据所在文件夹
#安装和加载所需包
BiocManager::install("Seurat") 
BiocManager::install("dplyr")
BiocManager::install("patchwork")
library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork) 

#导入示例数据
pbmc.data <- Read10X(data.dir = ".../filtered_gene_bc_matrices/hg19/")#自行填写数据所在文件夹
#创建Seurat对象
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
#过滤检测少于200个基因的细胞（min.features = 200）和少于3个细胞检测出的基因（min.cells = 3）
pbmc

#参数解释
CreateSeuratObject(
  counts, #未标准化的数据，如原始计数或TPMs
  project = "CreateSeuratObject",#设置Seurat对象的项目名称
  assay = "RNA", #与初始输入数据对应的分析名称
  names.field = 1,#对于每个cell的初始标识类，从cell的名称中选择此字段。例如，如果cell在输入矩阵					      #中被命名为BARCODE_CLUSTER_CELLTYPE，则设置名称。字段设置为3以将初始标识设置为				      #CELLTYPE。
  names.delim = "_", #对于每个cell的初始标识类，从cell的列名中选择此分隔符。例如，如果cell命名						 #为bar - cluster - celltype，则将此设置为“-”，以便将cell名称分离到其组成部分					    #中，以选择相关字段。
  meta.data = NULL, #要添加到Seurat对象的其他单元级元数据。应该是data.frame，其中行是单元格名称，列					#是附加的元数据字段。
  ...
  min.cells #包含至少在这些细胞检测到的features。
  min.features #包含至少检测到这些features的细胞
)

> pbmc
An object of class Seurat 
13714 features across 2700 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)
#1个数据集，包含2700个细胞，13714个基因。

数据矩阵

# 查看这三个基因的前三十行矩阵
pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]
> pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]
3 x 30 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
   [[ suppressing 30 column names ‘AAACATACAACCAC-1’, ‘AAACATTGAGCTAC-1’, ‘AAACATTGATCAGC-1’ ... ]]
                                              
CD3D  4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2
TCL1A . .  . . . . . . 1 . . . . . . . . . . .
MS4A1 . 6  . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . .
                          
CD3D   3 . . . . . 3 4 1 5
TCL1A  . 1 . . . . . . . .
MS4A1 36 1 2 . . 2 . . . .

.在矩阵中的值表示0(未检测到分子)。由于scRNA-seq矩阵中的大多数值为0,因此Seurat在任何可能的情况下都使用稀疏矩阵表示。这为Drop-seq/inDrop/10x数据节省了大量内存和速度。

标准的预处理流程

下面的步骤包含了Seurat中的scRNA-seq数据的标准预处理流程。包括QC（质控）、数据归一化以及细胞的选择和过滤。

QC和细胞筛选

常用的质控指标：

• 每个细胞在检测到的特异基因数
  • 低质量细胞或空液滴通常只能检测到非常少的基因
  • 两个或多个细胞被同时捕获通常会有很高的基因数
• 每个细胞检测到的分子总数（与基因密切相关）
• 每个细胞的线粒体基因比例
  • 低质量/濒死细胞常表现出广泛的线粒体污染
  • 使用PercentageFeatureSet()函数计算线粒体QC指标
  • 使用所有以MT-开头的基因作为一组线粒体基因

#向pbmc新增一列percent.mt数据
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

QC指标储存在哪？

每个细胞基因数和总分子数在建立seurat对象时就已经自动计算好了。

#展示前5个细胞的QC指标
head([email protected], 5)
> head([email protected], 5)
                 orig.ident nCount_RNA
AAACATACAACCAC-1     pbmc3k       2419
AAACATTGAGCTAC-1     pbmc3k       4903
AAACATTGATCAGC-1     pbmc3k       3147
AAACCGTGCTTCCG-1     pbmc3k       2639
AAACCGTGTATGCG-1     pbmc3k        980
                 nFeature_RNA percent.mt
AAACATACAACCAC-1          779  3.0177759
AAACATTGAGCTAC-1         1352  3.7935958
AAACATTGATCAGC-1         1129  0.8897363
AAACCGTGCTTCCG-1          960  1.7430845
AAACCGTGTATGCG-1          521  1.2244898

#使用小提琴图可视化QC指标
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

• nFeature_RNA代表每个细胞测到的基因数目。
• nCount_RNA代表每个细胞测到所有基因的表达量之和。
• percent.mt代表测到的线粒体基因的比例。

#FeatureScatter通常用于可视化 feature-feature 相关性，
#nCount_RNA 与percent.mt的相关性
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
#nCount_RNA与nFeature_RNA的相关性
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2 #合并两图

过滤线粒体基因表达比例过高的细胞，和一些极值细胞（可以根据小提琴图判断，查看两端离群值）。

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
#滤掉 2500 > nFeature_RNA >200 和percent.mt < 5的数据

数据标准化

默认情况下，使用全局缩放归一化方法“LogNormalize”，用总表达量对每个细胞的基因表达式进行归一化，再乘以一个缩放因子(默认为10,000)，然后对结果进行log转换。标准化的数值存储在pbmc[["RNA"]]@data中。

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

若所有调用的参数都是默认值，则可省去。

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

鉴定高变基因

接下来，计算数据集中表现出高细胞间变异的特征基因(即，它们在某些细胞中高表达，而在其他细胞中低表达)。这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。

用FindVariableFeatures()函数实现。默认情况下，每个数据集返回2000个features 。这些将用于下游分析，如PCA。

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# 查看最高变的10个基因
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# 画出不带标签或带标签基因点图
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

数据缩放

线性变换(“缩放”)，是在PCA降维之前的一个标准预处理步骤。ScaleData()函数功能:

• 转换每个基因的表达值，使每个细胞的平均表达为0

• 转换每个基因的表达值，使细胞间的方差为1

  • 此步骤在下游分析中具有相同的权重，因此高表达的基因不会占主导地位

• 结果存储在pbmc[["RNA"]]@scale.data中

all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

线性降维

接下来，对缩放的数据执行PCA。默认情况下，只使用前面确定的变量特性作为输入，但是如果想选择不同的子集，可以使用features参数来定义。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

Seurat提供了几种有用的方法来可视化细胞和定义PCA的特性，包括VizDimReduction、DimPlot和DimHeatmap

#查看PCA结果
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
> print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
PC_ 1 
Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
PC_ 2 
Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
PC_ 3 
Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 
PC_ 4 
Positive:  HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1 
Negative:  VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8 
PC_ 5 
Positive:  GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY 
Negative:  LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7 

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

DimHeatmap()可以方便地探索数据集中异质性的主要来源，并且可以确定哪些PC维度可以用于下一步的下游分析。细胞和基因根据PCA分数来排序。

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE) #1个PC 500个细胞

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE) #15个PC

确定数据的维度

主成分分析的原理非常简单，概括来说就是选择包含信息量大的维度（features），去除信息量少的“干扰”维度。所以这里会有个问题——如何知道保留几个维度是最佳的呢？我们希望通过保留尽可能少的维度来留存尽可能多的信息。Seurat有两种方法来确定维度。

• JackStraw

pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

​ 可以看出，在10-12个PC之后，显著性大幅下降，也就是前10-12个维度包含了大部分的样本信息。

• Elbow plot

ElbowPlot(pbmc)

可以看出，PC9-10附近有一个拐点（“elbow”），这表明大部分真实信号是在前10个pc中捕获的。

综合以上方法，选择10个主成成分作为参数用于后续分析。

细胞聚类

Seurat使用KNN算法进行聚类。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
#dims = 1:10 即选取前10个主成分来分类细胞。
#查看前5个细胞的分类ID
head(Idents(pbmc), 5)

非线性降维（UMAP/tSNE）

pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap")
# 显示在聚类标签
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE)
# 使用TSNE聚类
pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)
DimPlot(pbmc, reduction = "tsne")
# 显示在聚类标签
DimPlot(pbmc, reduction = "tsne", label = TRUE)

#保存rds，用于后续分析
saveRDS(pbmc, file = "../output/pbmc_tutorial.rds")

找差异表达基因(聚类标志cluster biomarkers)

利用 FindMarkers 命令，可以找到找到各个细胞类型中与其他类别的差异表达基因，作为该细胞类型的生物学标记基因。

• dent.1参数设置待分析的细胞类别

• min.pct参数，在两组细胞中的任何一组中检测到的最小百分

• thresh.test参数，在两组细胞间以一定数量的差异表达（平均）

• max.cells.per.ident参数，通过降低每个类的采样值，提高计算速度

# cluster 1的标记基因
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
head(cluster1.markers, n = 5)
#找出区分cluster 5与cluster 0和cluster 3的所有标记
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)
# 找出每个cluster的标记与所有剩余的细胞相比较，只报告阳性细胞
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_log2FC)

可视化

VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))

# you can plot raw counts as well
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", 
    "CD8A"))

#每个聚类前10个差异基因表达热图(如果小于10，则绘制所有标记)
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

鉴定细胞类型

这个数据集的markers与已知细胞的marker可以轻松配对。也可以通过查阅相关文献人工注释，或者利用singleR（挖个坑，有空再来填）自动注释。

Cluster ID	Markers	Cell Type
0	IL7R, CCR7	Naive CD4+ T
1	CD14, LYZ	CD14+ Mono
2	IL7R, S100A4	Memory CD4+
3	MS4A1	B
4	CD8A	CD8+ T
5	FCGR3A, MS4A7	FCGR3A+ Mono
6	GNLY, NKG7	NK
7	FCER1A, CST3	DC
8	PPBP	Platelet

#加上注释
new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono", 
    "NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

#保存
saveRDS(pbmc, file = "../output/pbmc3k_final.rds")

完整代码及示例数据领取：后台回复seurat领取。

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往期内容：

R绘图实战|GSEA富集分析图