翻译（4）siRNA

siRNAs

在植物中，约90％的小RNA是来源于双链前体的siRNA。它们的长度可以进一步分为21-nt，22-nt和24-nt类。属于21-nt和22-nt类的siRNA主要来源于病毒RNA，转座子和转座基因，并与AGO1结合以指导PTGS。相反，24-nt siRNA主要与异色转座因子（TEs）相关，并通过RNA定向的DNA甲基化（RdDM）在TGS中起作用。

siRNA的生物发生

如前所述，21-nt和22-nt siRNA来源于通过RNA介导的转录从病毒，转座子，转基因和某些DNA断裂区域表达的异常RNA （图3）。

siRNA生物发生和植物作用方式的插图。 Pol IV生成单链siRNA前体，然后通过RDR2将其转换为双链RNA（dsRNA），并通过DCL3将其加工为24-nt siRNA双链体。将甲基化的siRNA加载到AGO4中，然后将复合物募集到Pol V转录本，后者进一步募集DRM2以在RNA定向的DNA甲基化（RdDM）目标位点催化DNA甲基化。 Pol II也产生转录本，该转录本通过RDR6转化为dsRNA。 DCL2和DCL4将dsRNA加工成21-nt和22-nt siRNA，然后将其加载到AGO1中以通过转录物切割介导PTGS，或者通过与AGO2或AGO6结合来指导非规范的RdDM。

这些异常的RNA通常没有5'帽或3'聚腺苷酸化尾巴，使其成为RNA依赖的RNA聚合酶6（RDR6）的合适底物，从而将它们转化为dsRNA 。DCL4和DCL2分别将这些dsRNA切成21-nt和22-nt siRNA，通常将其掺入AGO1中，以指导PTGS靶向原始异常转录物进行切割。尽管DCL2和DCL4都可以处理RDR6依赖的dsRNA，但DCL4胜过DCL2，导致21-nt siRNA的丰度很高，而22-nt siRNA的含量低。但是，与DCL2处理过的22-nt siRNA相比，DCL4处理过的21-nt siRNA在招募RDR6触发次级siRNA方面效率较低。还发现缺陷的DCL4或过度表达的DCL2导致22-nt siRNA的水平高于野生型，并增强了AGO1介导的PTGS对转基因的活性。同样，DCL2中的突变抑制了拟南芥中依赖DCL2的22-nt siRNA和次级siRNA的积累。最新证据进一步表明，拟南芥DCL2而非DCL4通过生成22nt siRNA并募集RDR6用于次级siRNA生产，对于PTGS信号的可移植性传播，系统性传播至关重要。

属于24-nt类的siRNA主要来自转座子和重复元件（图3）。它们通过完善的典型的RdDM途径（需要Pol IV）在DNA甲基化和染色质修饰中发挥重要作用。植物特异性RNA聚合酶Pol IV在RdDM位点转录〜26–45 nt的单链siRNA前体，从而启动了24 nt siRNA的生物发生。RDR2转换为dsRNA的前体，随后被DCL3加工以产生24-nt siRNA双链体。HEN1使这些siRNA双链体甲基化，并将siRNA链整合到AGO4中。研究表明，24-nt siRNA双链体在细胞核中被加工，然后转移到细胞质中并整合到AGO4中。去除siRNA *链后，将siRNA-AGO4复合物导入核，以介导TGS。

除了这些依赖DCL的siRNA，在拟南芥中也发现了不依赖DCL的siRNA 。显示了，一些siRNA与AGO4相关联，并被3'至5'核酸外切酶修饰为一组具有相同5'端但3'端不同的异源siRNA。

siRNA的作用方式

如前所述，siRNA通过PTGS和TGS抑制其靶标的表达（图3）。

优先将依赖于Pol II和RDR6的21-nt和22-nt siRNA整合到AGO1中，以指导转录物切割其靶标。这引起从靶标转录物依赖RDR6的次级siRNA扩增，沉默信号在植物中的系统传播，表明了植物防御的机制。除PTGS外，一些依赖于Pol II和RDR6的siRNA，通常是来自转座子的siRNA，还可以通过与AGO2或AGO6结合，通过非规范的RdDM途径介导靶位点的更始(de novo)DNA甲基化。

Pol IV和RDR2依赖性的24 nt siRNA在很大程度上指导了规范的RdDM。形成siRNA-AGO4复合物后，植物特异性RNA聚合酶Pol V会在Pol IV转录位点附近产生约50 nt长度的非编码转录物，并通过序列互补性招募siRNA-AGO4复合物。这进一步募集了DNA重新排列的甲基化酶2（DRM2），以在CG，CHG和CHH序列上下文（H代表C，T或A）中触发更始DNA甲基化。CHH甲基化的维持需要24-nt siRNA和RdDM，而DNA甲基转移酶1（MET1）和染色体甲基化酶3（CMT3）分别以siRNA独立的方式维持CG和CHG甲基化。此外，24-nt siRNA定向的DNA甲基化主要发生在常色染色质臂上，因为RdDM必需的一种必需蛋白，即，在异色区功能无效 ，RNA定向DNA甲基化1（DRD1）的缺陷。CMT2以不依赖siRNA的方式介导着丝粒附近的异色区域的DNA甲基化。尽管如此，CMT2基因座也产生了依赖于Pol IV和RDR2的24-nt siRNA，尽管其功能尚不清楚。

在大多数情况下，RdDM靶向基因间区域和转座子。但是，还提出了依赖于24 nt siRNA的RdDM来调节某些蛋白质编码基因。据报道，核糖核酸酶III（RNase III）酶RNASE THREE-LIKE 2（RTL2）将dsRNA加工成> 24-nt siRNA双链体，然后由DCL3进一步加工成24-nt。在功能丧失的rtl2突变体中，某些蛋白质编码基因与野生型相比显示出降低的表达水平，并且植物显示出发育缺陷，该缺陷可通过突变NRPD1来恢复，而NRPD1编码Pol IV的最大亚基。

24 nt转座因子（TE）衍生的siRNA的生物学功能

24 nt TE衍生的siRNA的主要作用之一是以非细胞自主方式指导繁殖过程中DNA甲基化的动态重编程。在雌配子体中，中心细胞经历表观遗传的CHH甲基化消耗和TEs的活化，导致产生进入卵细胞并增强其中DNA甲基化的24-nt siR-NAs。在发育中的花粉中，小孢子中的CHH甲基化大量丢失，随后在营养细胞中恢复，因为各种TE在营养核中进行了过渡性重新活化，并产生了可指导DRM2依赖性的24-nt siRNA CHH 甲基化。但是，精子细胞缺乏DRM2的表达，减少的CHH甲基化只有在受精后才能恢复，这可能是由于从营养细胞中转移的24 nt siRNA的活性所致。同样，在受精后的种子发育过程中，DNA甲基化水平会动态变化，胚乳中产生的24 nt siRNA进入胚胎，从而在CHG和CHH环境中重置DNA甲基化。这些发现共同突出了hc-siRNA在植物繁殖中的重要功能。