Nature Methods | 破解10nm以下光学成像难题，深入细胞亚结构
原创 苏安 图灵基因 2022-08-14 15:49 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术
撰文：苏安
IF：47.99
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亮点：
本文的研究团队发现了间隔小于10nm的荧光团之间的共振能量转移会引起加速的荧光闪烁，从而导致定位概率的降低，阻碍10nm以下的荧光成像；并且作者的研究团队通过对具有不同荧光团间距离DNA折纸的研究，证明了光开关指纹分析与时间分辨荧光检测相结合的方法可以克服10nm以下超分辨率成像的难题。
在过去的十年中，通过单分子定位的超分辨率荧光成像已经发展成为细胞亚分辨度荧光成像和亚细胞结构研究的强大方法。尽管单分子定位显微镜（SMLM）方法现在可以提供远低于光学显微镜的衍射极限，即大约20nm的空间分辨率，但它不能提供几纳米的真实分子分辨率，这是全面了解细胞或组织等真实生物样品中多蛋白复合物或蛋白质密集网络的组成和3D组织所必需的，所以当前在生物样品中将如此高的定位精度转化为低于10nm的空间分辨率仍然具有挑战性。
近期世界著名的超分辨率显微镜科学家 Markus Sauer在Nature methods 上发表了一篇名为Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier的文章，在这篇文章中，作者通过研究向我们解释了是什么原因影响了10nm以下超分辨率显微镜的成像难题，并且作者通过一种新的方法——光开关指纹分析，解决了10nm以下超分辨率的成像问题，这项研究推动了超分辨显微镜领域的技术发展，并大大加深了科学家对亚细胞结构的研究。
在单分子定位显微镜中（SMLM），决定图像分辨率的三个重要参数分辨是，定位精度，系统偏差和标记密度，其中定位精度对图像分辨率的影响最为关键。为了破译SMLM方法在10nm以下状态下面临的限制，作者研究了具有不同荧光团间距离的DNA折纸。作者的数据表明，开/关光开关动力学强烈依赖于亚10nm范围内的荧光间泳团距离。作者展示了光开关指纹分析与时间分辨荧光检测相结合如何克服这些限制。他使用DNA折纸在不同距离携带四个荧光团来证明这一概念，并通过研究由遗传密码扩增（GCE）标记的细胞中低聚受体亚基的化学计量学和荧光间团距离和非天然氨基酸的点击标记来举例说明其向生物系统的翻译。
为了更详细地研究与10nm以下荧光成像相关的问题，作者设计了DNA折纸，携带四种Cy5染料，分别由18nm，9nm，6nm和3nm分离，并通过生物素 - 链霉亲和素结合将它们固定在盖玻片上（图1a)。作为参考，作者使用了只用一个Cy5标记的相同的DNA折纸。dSTORM成像在标准光开关缓冲液中仅使用640 nm的照射进行，虽然在某些情况下，dSTORM可以在18nm距离处解析四个荧光团，但它不能解析由9nm，6nm和3nm分隔的荧光团（图1b）。为了直接比较，作者使用Cy3B标记的成像器进行了DNA-PAINT（图1c）。虽然DNA-PAINT实现了更高的空间分辨率，但也无法在6nm和3nm的距离内解析荧光团。更令作者印象深刻的是光开关动力学的特殊差异，即从6 nm和3 nm DNA折纸录制的dSTORM视频中明显闪烁。在最初的几秒钟内和几分钟后比较荧光信号密度清楚地证明，更快的闪烁伴随着更快的光漂白（荧光团的不可逆破坏）。这些观察结果表明，在较短的荧光团间距离下，Cy5染料的开/关光开关动力学显着加速。
为了解释所描述的能量转移过程如何在10nm以下的范围内损害dSTORM，作者分析了在5 ms的时间分辨率下从不同DNA折纸记录的荧光轨迹（图1d）。对在光开关缓冲液中测量的单个DNA折纸的闪烁模式的分析，结果表明多个标记的DNA折纸的导通状态与单个染料参考相比，显示出相似的寿命（导通时间），但与单个染料参考相比，关闭状态寿命更短。此外，数据明确指出，关断时间随着荧光间距离的减小而减小（图1e），即光活化速率随着荧光团间距离的减小而增加。由于用葡萄糖氧化酶检测到的on事件数量较低，作者在以下实验中使用了不含葡萄糖氧化酶的标准光开关缓冲液。正如预期的那样，只有单独标记的参考显示更长的关断时间和更少的打开事件（图1f）。
在dSTORM和DNA-PAINT实验中，由于分别不完全掺入修饰的寡核苷酸和标记，导致定位概率很低，在这里，作者向我们展示了单标记的参考和9nm和18nm DNA折纸显示出定位数量随时间的线性增加（图1g），并且每个DNA折纸根据检测到的定位时间的分布证实了大多数3nm和6nm DNA折纸在最初几分钟内快速闪烁（图1h）。
因此，作者的研究数据的数据表明，从用Cy5荧光团标记的样品中检测到的定位的时间发展在<10nm的荧光团间距离处发生变化，即间隔小于10nm的荧光团之间的共振能量转移会引起加速的荧光闪烁，从而导致定位概率的降低，阻碍10nm以下的荧光成像。图1.DNA折纸的dSTORM和DNA-PAINT成像
为了获得潜在光物理学的更详细的图像，作者通过时间分辨共聚焦单分子荧光显微镜研究了具有更高时间分辨率的单个DNA折纸（图2a-e）。他们以非常低的照射强度扫描单分子表面，以尽量减少过早的光漂白，选择单个DNA折纸并将其停放在激光聚焦中以记录荧光强度和寿命随时间的变化。在光开关缓冲液中，参考DNA折纸显示闪烁，具有短导通状态和长关闭状态（图2a）。正如四个独立发射荧光团的预期一样，18nm DNA折纸每次以相似的强度显示更多的切换事件（图2b）。9 nm DNA折纸表现出非常相似的行为;然而，轨迹的某些部分表明闪烁更快，特别是在照射开始时（图2c）。相比之下，一些6 nm和3 nm DNA折纸在轨迹的最初阶段显示出非常快速的闪烁。轨迹前几秒钟的放大视图表明，荧光间团距离为3nm和6nm的DNA折纸的离态寿命要短得多，也就是说，眨眼发生在毫秒时间尺度上（图2d，e）。
为了剖析两种不同的能量转移途径（反式/顺式和开/关），我们研究了在没有光开关的情况下的3nm DNA折纸，即在PBS中，pH 7.6含有1 mM trolox /trolox醌和除氧系统以延长观察时间。在照射的最初几秒钟内，3 nm DNA折纸的荧光轨迹在trolox缓冲液中显示出相似的闪烁行为，但荧光强度水平更高（图2f）。在光开关缓冲液中记录的3 nm DNA折纸的荧光衰变表现出多指数动力学，其荧光寿命分量较短，约为400 ps（图2g）。与此同时，一个额外的小开/关分量出现在几百微秒范围内，我们将其归因于从开-状态到关状态的能量转移，然后是导通状态的重新填充（图2h）。
总之，荧光团间距离决定了dSTORM实验中的关态寿命，并且也编码在荧光寿命中，而检测到的on事件数包含有关存在荧光团数量的信息。因此，随着荧光团间距离的减小，DNA折纸的荧光寿命减小（图2i）。此外，随着荧光团光漂白的进展，3 nm DNA折纸中荧光团的荧光寿命在荧光轨迹期间增加（图2j），这表明导通状态的淬火效率由存在的关断状态的数量决定。在trolox缓冲液中测量的四个DNA折纸的荧光寿命成像显微镜（FLIM）图像表明，单个18nm和9nm DNA折纸的成像寿命约为2 ns，而6nm和3nm DNA折纸的荧光寿命明显较短（图2k）。图2.各种能量转移途径负责在10nm以下范围内观察到的快速闪烁。
为了将作者的发现转化为生物学应用，即细胞中的超分辨率成像，他们必须首先解决标记问题。虽然用有机染料对DNA折纸进行位点特异性和有效的标记很简单，但仅隔只有几纳米的生物分子的位点特异性荧光标记仍然具有挑战性。解决标记问题的一种方法是将有机染料直接共价位点特异性附着到感兴趣的蛋白质上，这可以通过GCE将非正统氨基酸（ncAA）掺入感兴趣的蛋白质中来实现，该蛋白质可以通过生物正交点击化学与小型有机染料进行有效标记来实现。
该方法能够对细胞内和细胞外蛋白质进行位点特异性高效标记，其连接误差约为1nm，具有适合有机染料的超分辨率显微镜。作者的研究最终证明，用小丁嗪染料对ncAA进行点击标记是一种多功能工具，用于标记在拥挤的环境中难以进入的空间位点（图3a-g）。图3.细胞中时间分辨光开关指纹图谱分析。
教授介绍：
Markus Sauer
维尔茨堡大学生物技术与生物物理学，生物中心主席。Sauer在海德堡大学获得物理化学博士学位，然后在劳伦斯伯克利国家实验室获得奖学金，为了了解有关量子点，纳米晶体和单分子能量转移的更多信息，他在海德堡获得了额外的哈比勒博士学位，并获得了比勒费尔德大学的教授职位。2009年，他加入维尔茨堡大学，为物理学家、化学家和生物学家教授生物物理学。研究领域：单分子荧光光谱与成像、超分辨率显微镜。
人类感染过程的时间和空间精度依赖于宿主和病原体的精确和特异性相互作用。对这些过程的研究需要复杂的分析方法。大多数感染因子（细菌，病毒）和宿主亚细胞区室的小尺寸需要以接近电子显微镜的空间分辨率成像，以深入了解宿主病原体相互作用的分子结构和组织。Markus Sauer的项目旨在开发精细的定位显微镜方法（dSTORM和PALM），能够以无与伦比的空间分辨率提供有关分子分布和密度的定量信息。
参考文献：
Helmerich, D.A., Beliu, G., Taban, D. et al. Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier. Nat Methods 19, 986–994 (2022).