10X空间转录组Visium:基本概念

2019年12月3日10X空间转录组Visium流程发布了，不再是Coming soon...。流程打包Space Ranger软件里面，感兴趣的小伙伴可以安装下来学习了，自带了数据集，还奉送了代码。可以说真香。

我是你想要的数据集

我相信每一个新产品都是新的概念的组合，所以在我们开始之前来学习一下关于Visium的基本概念吧。

我是砖，快来搬我-><-10xgenomic|spatial|gem_well

10X Visium:空间转录组样本制备到数据分析
10X空间转录组的一个案例：小鼠大脑
10X空间转录组WORKFLOW

Visium-specific Terms

用于生成Visium数据的显微载玻片（slides ）具有 Space Ranger 用户需要知道的特性。为了运行Space Ranger，必须生成要分析的数据载玻片相关的序列号，以及与每个样本的捕获区域。

下面的图片说明了Visium（slides ）的这些关键特性对应的词汇表解释了这些术语。

• 校准文件alignment file - 使用手动对齐和手动组织检测时，使用 Loupe Browser生成的文件 。

• 区域（or capture area）-可以将组织放置在Visium玻片上的四个活动区域之一。每个区域仅包含一个组织样本。玻片区域从上到下依次命名：A1，B1，C1，D1。

• brighfield图像：组织的光学显微镜图像。在Visium实验中，brighfield图像用作解剖参考。这些图像通常用苏木精和曙红染色以突出组织结构（请参见下面的H＆E染色）。
  

• capture spots :这些是载玻片上不可见的spots，它们含有专门用于捕获聚腺苷酸mRNA的寡核苷酸

• fiducial spots: 围绕每个捕获区域的特殊图案点的框架。这些斑点帮助样本显微镜观察组织的放置位置，也被 Space Ranger用来确定图像中捕获区域的位置。

• glyphs : 捕捉区域每个角落的基准点，使用容易识别的形状:沙漏，三角形，开放的六边形，填充六边形。

• H&E staining: 苏木精（Hematoxylin ）和伊红（eosin ）在组织上的染色以突出组织结构。苏木精使细胞核呈蓝色，伊红使胞质和细胞外基质呈粉红色。

• sample: 单个组织切片应用于Visium玻载片上的单个区域或由此得出的数据。

• slide file : 在一张载玻片中描述捕获点布局的文件，由载玻片序列号标识。

• slide serial number : 印在每张Visium玻载片标签上的唯一标识符。序列号以“V1”开始，以一个破折号和一个三位数字(如123)结束。

RNA-seq Terms

count matrix (or feature-barcode matrix) : 一个矩阵计数矩阵，代表每个spot 条形码中每个特征(基因)的独特观察数。转录组参考定义的基因以行形式出现在矩阵中，每个条形码是矩阵的一列。

Sequencing Terms

dual indexing : 一种通过使用两个寡核苷酸序列对同一flowcell上的多个样本进行测序的策略，其中一个寡核苷酸序列连接到每个待测序片段的两端，以唯一地识别样本。Visium库构建只支持使用这种双索引策略的多路复用样本。参见下面的示例索引.

更多介绍参见：Understanding unique dual indexes (UDI) and associated library prep kits

文章：An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S

library (or sequencing library) : 从单个载玻片区域制备的Visium空间条形码测序库。

sample index: 一种寡核苷酸序列，用于构建文库以区分在同一flowcell上测序的多个样本。在Illumina平台上，这些序列作为单独的“索引读取”被读取，并使用mkfastq将读取结果排序到特定于样本的文件中。Visium库结构只支持“dual-indexing”(见上文)。

sequencing run (or flowcell): Illumina BCL文件数据可以通过lane或样本索引进行多路复用。有关多路解复用的更多信息，请参见mkfastq。

有了这些文件就可以用官方软件跑流程啦。

spaceranger-1.0.0/spaceranger count -h 
/TJPROJ5/SC/pipeline/10X_RNA/Development/SpaceRanger/spaceranger-1.0.0/bin
spaceranger count (spaceranger-1.0.0)
Copyright (c) 2019 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------

'spaceranger count' quantifies spatial gene expression.

The commands below should be preceded by 'spaceranger':

Usage:
    count
        --id=ID
        --fastqs=PATH
        --transcriptome=DIR
        --image=IMG
        (--slide=SLIDE --area=AREA | --unknown-slide)
        [options]
    count   [options]
    count -h | --help | --version

Arguments:
    id                  A unique run id and output folder name [a-zA-Z0-9_-]+.
    fastqs              Path of folder created by mkfastq or bcl2fastq.
    sample              Prefix of the filenames of FASTQs to select.
    image               Brightfield tissue H&E image in .jpg or .tiff format.
    transcriptome       Path of folder containing 10x-compatible reference.
    slide               Visium slide serial number, for example V10J25-015.
    area                Visium area identifier, for example A1.
    unknown-slide       Set this if the slide serial number and area identifier
                            are unknown. WARNING: should only be used as a last
                            resort. Setting this will cause Space Ranger to use
                            default spot positions. Not compatible with --slide
                            and --area, or --slide-file.

Options: