粪便DNA的提取过程

操作步骤:

1. 请自行准备:无水乙醇、异丙醇、PBS、1.5mLDNase-free 灭菌离心管。

2. 取出洗涤液,按以下操作:

a) 洗涤液 A:21mL 加入 9mL 无水乙醇;42mL 加入 18mL 无水乙醇,混匀。

b) 洗涤液 B:18mL 加入 42mL 无水乙醇;36mL 加入 84mL 无水乙醇,混匀。

c) 配制好的洗涤液如出现沉淀,可在 37℃溶解,摇匀后使用。

3. 取 200mg 的粪便于 1.5mL DNase-free 灭菌离心管中 (若粪便样本为液态,取 200μL 于离心管中),加入1mL PBS 充分振荡混匀,300g离心 5 分钟,收集上清。取收集的上清液 0.9mL 于 1.5mL DNAse-free 灭菌离心管中,12000 rpm 离心 5 分钟,弃 0.8mL 上清,振荡重悬剩余沉淀和液体。a) 对于革兰氏阴性菌和一般的革兰氏阳性菌、肠道脱落细胞,直接进行骤 步骤 4 操作; b) 对于细菌壁较厚的革兰氏阳性菌、真菌、细菌芽孢等须首先进行破壁处理,可将上述沉淀用少许液氮反复研磨 3 次,再进行步骤 4 操作。

4. 加入 200 μL 裂解液, 20μL 消化液,充分振荡混匀,65℃水浴 10 分钟。

5. 加入 450μL 异丙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响 DNA 的提取与后续实验。

6. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液全部转入吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。

7. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内,静置 1 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。

8. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。

9. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。

10. 按每份样本 40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。

11. 将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。

12. 取出吸附柱,放入新的 1.5mL DNase-free 灭菌离心管内,在吸附柱中心加入 40 μL 预热洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。

注意事项:

裂解液、洗涤液 含有刺激性化学 物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛,请立即用清水或生理盐水冲洗,必要时请就医。

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