粪便DNA的提取过程

操作步骤：

1. 请自行准备：无水乙醇、异丙醇、PBS、1.5mLDNase-free 灭菌离心管。

2. 取出洗涤液，按以下操作：

a) 洗涤液 A：21mL 加入 9mL 无水乙醇；42mL 加入 18mL 无水乙醇，混匀。

b) 洗涤液 B：18mL 加入 42mL 无水乙醇；36mL 加入 84mL 无水乙醇，混匀。

c) 配制好的洗涤液如出现沉淀，可在 37℃溶解，摇匀后使用。

3. 取 200mg 的粪便于 1.5mL DNase-free 灭菌离心管中 (若粪便样本为液态，取 200μL 于离心管中)，加入1mL PBS 充分振荡混匀，300g离心 5 分钟，收集上清。取收集的上清液 0.9mL 于 1.5mL DNAse-free 灭菌离心管中，12000 rpm 离心 5 分钟，弃 0.8mL 上清，振荡重悬剩余沉淀和液体。a) 对于革兰氏阴性菌和一般的革兰氏阳性菌、肠道脱落细胞，直接进行骤 步骤 4 操作; b) 对于细菌壁较厚的革兰氏阳性菌、真菌、细菌芽孢等须首先进行破壁处理，可将上述沉淀用少许液氮反复研磨 3 次，再进行步骤 4 操作。

4. 加入 200 μL 裂解液， 20μL 消化液，充分振荡混匀，65℃水浴 10 分钟。

5. 加入 450μL 异丙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响 DNA 的提取与后续实验。

6. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液全部转入吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

7. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内，静置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

8. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

9. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

10. 按每份样本 40μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 400μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。

11. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。

12. 取出吸附柱，放入新的 1.5mL DNase-free 灭菌离心管内，在吸附柱中心加入 40 μL 预热洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。

注意事项：

裂解液、洗涤液 含有刺激性化学 物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时请就医。