DNA 修复基因标记是定制免疫疗法的有前途的生物标志物（IF6+）

A Novel DNA Repair Gene Signature for Immune Checkpoint Inhibitor-Based Therapy in Gastric Cancer

一种基于免疫检查点抑制剂的胃癌免疫修复基因特征

发表期刊：Front Cell Dev Biol

发表日期：2022 May 23

DOI:  10.3389/fcell.2022.893546

期刊相关信息

一、背景

        胃癌是全球最常见的癌症之一，2020年新发病例超过100万，发病率在全球排名第五，死亡率在全球排名第三。化疗是胃癌的标准治疗方法，可作为术前或术后治疗，适用于疾病的所有病理阶段。一些治疗方案在某些患者中显示出更好的5年生存率（OS）或无复发生存率（RFS）。近年来，多种免疫检查点抑制剂（ICI）的批准以及肿瘤免疫疗法的临床试验所取得的可喜成果，促使了肿瘤免疫疗法的发展。在ICI疗法中，抗PD-1和抗PD-L1抗体以及抗CTLA4抗体对微卫星不稳定性高（MSI-H）亚型或PD-L1高表达的患者非常有效。

        在某些类型的肿瘤中已经观察到基因不稳定或DNA修复缺陷与肿瘤对免疫疗法的敏感性之间的联系。已发现DNA损伤和基因组不稳定性会影响抗肿瘤免疫反应。肿瘤免疫治疗的应用仍有许多挑战，例如，只有一小部分肿瘤是易感的，总体临床反应率较低，仍然难以准确预测疗效和反应。这样的局限性使得人们有理由寻找新的免疫治疗生物标志物，如基于PD-L1表达、肿瘤浸润淋巴细胞、TMB、缺失的MMR、免疫基因签名和多重免疫组化等。

二、材料与方法

1.数据来源

1）从癌症基因组图谱胃腺癌（TCGA-STAD）数据集下载407名胃癌患者的下一代测序数据和临床病理信息

2）从GEO数据库下GSE30727中60名胃癌患者的微阵列数据载

3）使用带有免疫疗法信息的数据集[R软件包 "IMvigor210CoreBiologies"]

4）从GDSC下载体外不同胃癌细胞间的药物敏感性数据

5）公共数据集IMvigor210CoreBiologies共包含348名接受阿特唑仑治疗的晚期尿道膀胱癌患者

6）从GEO数据库中下载了三个独立的胃癌数据集GSE26901、GSE15459和GSE26899作为验证集

7）从GDSC下载药物敏感性数据，结合23种胃癌细胞的RNA-seq数据

8）10名胃癌患者组织切片

2.实验流程

1） 15-DNA修复基因特征（DRGS）和评分系统的构建：从人类DNA修复基因网站中，定义了219个DNA修复基因的名单；差异表达分析；采用PCA作为降维方法，得到15个基因的一维相关系数

2） 免疫细胞浸润的比较：ImmuCellAI确定DRGS评分系统与胃癌组织中免疫细胞浸润之间的关系；计算了相同的TCGA-STAD样本的DRGS分数，并使用中位数分数作为临界点，将这些样本分为高分亚型和低分亚型；对两组之间浸润分数明显不同的免疫细胞进行了分层聚类；使用ImmuCellAI来预测患者对ICB治疗的反应

3） 组织学和分子特征的综合分析：来自上述两组的样本（TCGA-STAD，高分n = 187，低分n = 188）被用来探讨DRGS评分与各种肿瘤特征之间的关系

4） 15-DNA修复基因特征评分与免疫治疗结果的关系、预后能力：生存分析、单变量和多变量的Cox回归

5） 15-DNA修复基因特征评分与药物敏感性的关系

6） 免疫组化分析：10名胃癌患者组织切片

7） 预后相关的15-DNA修复基因特征和PD-L1表达的验证：对IHC结果和人类蛋白质图谱（HPA）的数据进行分析

三、实验结果

01、15 DNA修复基因特征的鉴定及评分系统的构建

        从人类DNA修复基因网站上获得219个DNA修复基因，使用R中的DEseq2包来处理TCGA-STAD的原始数据，并使用在线平台GEO2R来寻找肿瘤（n = 375）和正常（n = 32）组织之间差异表达的基因。最后，在219个DNA修复基因中确定了15个共同的基因，这些基因在TCGA-STAD和GSE30727（肿瘤n = 30，正常n = 30）中均有差异表达（图1A）。然后用PCA分析作为降维方法，得到15个基因的一维相关系数（图1B）。基于这些系数，我们创建了一个15个DNA修复基因特征（DRGS）评分系统，用DRGS评分将患者分为两组（高分组和低分组）。

图1 DNA修复基因和DRGS评分系统的构建

02、不同15-DNA修复基因特征评分组的免疫特征

        作者通过ImmuCellAI识别375个TCGA-STAD样本的免疫特征，以估计每个胃癌样本中24种免疫细胞的具体分数。为了分析不同分数亚组（高分n = 187，低分n = 188）的免疫细胞组成，比较了两组中免疫细胞类型的分布。结果显示，两组间14种免疫细胞的浸润率存在明显差异：抗肿瘤细胞如γδT细胞、中性粒细胞和Th1细胞在DRGS高分组中更为丰富，而免疫抑制或肿瘤增强细胞如B细胞、CD4 T细胞、单核细胞、Th17细胞、Tfh细胞和Tr1细胞在DRGS低分组更为丰富（图2，图3A）。DRGS低分组样本的浸润分数明显高于高分组（图3B）。此外，用ImmuCellAI预测ICB治疗的反应，发现在DRGS高分组中会有53.5%的患者对ICB治疗有反应，而DRGS低分组的患者较少（37.8%）（图3C）。

图2 DRGS高分和低分亚组的免疫细胞类型浸润情况

图3 DRGS得分亚组的免疫特征

03、15-DNA修复基因特征得分组与其他组织学和分子分类的关系

        为了研究分数分组与其他组织学和分子分类之间的关系，作者分析了TCGA-STAD数据库中372个胃癌患者样本的临床数据。根据先前研究的分类，胃癌可分为3个亚型，即肠型、弥漫型和混合型。在本研究中，DRGS高分组（n = 115）的特点是肠道亚型样本的比例非常高（86.1%），而弥漫型和混合型亚型样本分别只有7.8%和6.1%。另一方面，DRGS低分组（n = 115）由51.3%的肠道样本、40.0%的弥漫型和8.7%的混合型样本组成。据统计，与低分组相比，DRGS高分组的肠道型胃癌样本明显较多，弥漫型胃癌样本较少（图4A）。

        TCGA提出了4种胃腺癌亚型：1）EB病毒阳性；2）微卫星不稳定（MSI）；3）基因组稳定（GS）；4）染色体不稳定（CIN）。在本研究中，DRGS高分组（n = 169）的EB病毒阳性（11.2%）和MSI（27.8%）亚型样本的比例较高。相反，DRGS低分组（n = 169）有较高比例的GS（23.1%）和CIN（63.9%）亚型样本（图4B）。

        根据微卫星标志物的突变频率，胃癌可分为MSS、MSI-H和MSI-L。在本研究中，DRGS高分组（n = 120）中MSI-H亚型患者的比例（31.7%）高于低分组（7.5%）（n = 120）。相反，DRGS低分组的MSS亚型患者（72.5%）多于高分组（55.8%）(图4C)。

图4 分数分组与其他组织学和分子学分类之间的关系

04、15-DNA修复基因特征评分的预后能力

        为了研究DRGS评分的预后影响是否独立于可能与患者结局相关的临床因素，作者首先对TCGA-STAD数据集中所有可用的临床参数（n = 372）进行单变量Cox回归分析，选择了对预后有重大影响的临床参数与DRGS一起进行多变量Cox回归分析。结果表明，DRGS是一个独立的预后因素。以中位数为分界值，DRGS高分的患者比DRGS低分的患者有更好的OS（图5A）。然后，使用GSE26901（n = 109）、GSE15459（n = 192）和GSE26899（n = 93）胃癌数据集验证了评分系统的预后价值。如图5所示，GSE26901中DRGS高分组的患者预后明显好于低分组的患者（图5B），与TCGA数据集的结果一致。然而，在GSE15459（图5C）或GSE26899（图5D）两个DRGS组之间没有明显的OS差异。

图5 使用各种公开的胃癌数据集的DRGS评分系统的预后能力

05、15-DNA修复基因特征评分的分子特征

        为了确定TMB和DRGS评分之间的关系，作者分析了TCGA-STAD的365份胃腺癌样本的体细胞突变数据。结果表明，DRGS评分与TMB呈正相关（图6A）。DRGS高分组（n = 183）的样本TMB明显高于DRGS低分组（n = 182）（图6B）。所有的突变事件被分为不同的类别，其中错义突变在变异分类中占最大比例（图S2A，B），单核苷酸多态性（SNPs）的发生频率远远高于插入或缺失，C>T是所有TCGA-STAD样本中最常见的单核苷酸变异（SNV）。值得注意的是，DRGS高分组的每个样本的变异中值（121）高于DRGS低分组（59.5）。此外，瀑布图还显示了每个样本中前10个突变基因的突变事件。在DRGS高分组中，TTN的突变频率最高（59%），其次是TP53（54%）和MUC16（39%，图S2B）。在DRGS低分组中，突变频率最高的基因是TP53（34%），其次是TTN（33%）和MUC16（21%，图S2A）。

图S2 TCGA-STAD 突变概述

        PD-L1表达是对PD-L1阻断易感性的另一个重要生物标志物。发现DRGS高分组（n = 183）的PD-L1表达明显高于DRGS低分组（n = 182）（图6D）。DRGS得分与PD-L1表达呈正相关（图6C）。

图6 两个DRGS评分组的分子特征

06、PD-L1阻断剂的免疫治疗在不同的15-DNA修复基因特征评分组中的益处

        作者测试了DRGS评分系统预测患者对免疫疗法反应的能力，该分析基于IMvigor210CoreBiologies队列（n = 348），研究PD-L1阻断与atezolizumab在转移性尿路上皮癌（mUC）中的临床活性。发现DRGS高分患者（n = 174）表现出突出的总生存期延长（图7A）。此外，该队列中298名患者对抗PD-L1阻断剂表现出不同程度的反应，DRGS高分患者（n = 149）包括14.8%的完全反应（CR），18.8%的部分反应（PR），18.8%的稳定疾病（SD）和47.6%的进展性疾病（PD），而DRGS低分患者（n = 149）包括2.0%的CR，10.1%的PR，23.5%的SD和64.4%的PD。在DRGS高分组和低分组之间进行的Chi-squared检验也显示，DRGS高分患者的治疗效果明显优于低分患者（图7B）。

        作者还分析了两组DRGS患者IMvigor210CoreBiologies的三种免疫亚型（免疫发炎、免疫排除和免疫沙漠）。DRGS高分患者（n = 142）包括33.1%发炎，45.8%排除和21.1%沙漠，而DRGS低分患者（n = 142）包括19.0%发炎，48.6%排除和32.4%沙漠。因此，与低分患者相比，DRGS高分患者的 "免疫发炎 "肿瘤比例明显较高，而 "免疫沙漠 "和"免疫排除 "肿瘤的比例较低（图7C）。

图7 在两个DRGS评分组中，PD-L1阻断剂的免疫疗法的好处

07、15-DNA修复基因特征得分及其潜在的化疗价值

        为了探索DRGS评分系统对化疗中药物反应的影响，作者评估了DRGS评分与癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库中的胃癌细胞系（n = 23）对药物反应的关联。确定了5个DRGS评分和药物敏感性之间的显著相关对，所有这些都显示了与DRGS评分相关的耐药性，包括胰岛素样生长因子受体IGF1R_3801，AKT抑制剂ipatasertib，生存抑制剂sepantronium bromide，ULK1蛋白激酶ULK1_4989和AKT抑制剂uprosertib（图8A）。此外，发现这些药物大多针对PI3K/MTOR、IGF1R和凋亡调节信号通路（图8B）。

图8 DRGS评分在化疗中的潜在治疗价值

08、免疫组化验证15-DNA修复基因特征中的基因表达及与PD-L1表达的关系

        通过IHC分析，发现在胃肿瘤组织中（n = 10），除PARPBP、EME1和RAD54L外，DRGS中大多数基因的蛋白表达都明显增加（图9A）。在HPA数据中，与正常组织相比，除了FANCA、UBE2T、POLQ、EXO1和XRCC2（它们没有被包括在内），DRGS的表达明显上调（图9B）。

图9 胃癌组织和正常组织中DRGS基因的蛋白质水平

        作者还分析了DRGS和PD-L1蛋白表达之间的关系。如图10A,B所示，根据IHC分析（n = 10），除PARPBP、EME1和RAD54L外，DRGS中的基因的蛋白表达与PD-L1表达呈正相关（图10A,B）。在HPA数据中，PRKDC、FANCI、LIG1、RECQL4、FANCA、PARPBP、RAD54L和FANCD2（其余15个基因不包括在内）的蛋白水平与PD-L1的蛋白水平呈正相关（图10C）。

图10 PD-L1和DRGS之间蛋白质表达的相关性

四、结论

        本研究开发了一种新的15-DNA修复基因特征（DRGS）及其相关评分系统，并评价了DRGS在鉴别胃腺癌患者不同分子和免疫特征及治疗结果方面的效率。结果表明，与DRGS低分患者相比，DRGS高分患者对ICB的治疗结果明显更好。多组学数据综合分析表明，DRGS评分高的患者具有抗肿瘤淋巴细胞浸润水平高、肿瘤突变负荷（TMB）和PD-L1表达高等特征，与低评分患者相比，这些患者表现出更长的总生存期。DRGS是预测患者对基于免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗反应的一个有希望的指标，需要进一步的研究来评估DRGS对于调整免疫疗法的临床效用。