流式细胞术原理

流式细胞术公开课

image.png

image.png

image.png

1. 流式细胞仪

1.1 模型

image.png

image.png

image.png

1.2 液流系统

image.png

image.png

会形成鞘液流（鞘液是为了保证细胞在中间形成单个排列的细胞流，因为要保证激光覆盖整个样本中心流）在外周，样本流在中央的层流状态，使得样本仅在轴心

image.png

激光照射到样本流上，激光60um宽，20um高（宽高有限，只有样本流刚好在中间才能保证激光能覆盖样本流细胞）

image.png

样本流中的细胞表面的荧光抗体受到激光的照射以后，会被激发出荧光；

有两个镜头接受荧光信号，
一个是forward scatter-FSC检测器（前向散射光），另一个是side scatter-SSC侧向轴检测器/荧光信号检测器（与激光90度）

image.png

收集到的光信号就被光纤传导到光分离系统中去了，

1.2.3光收集系统

image.png

小知识：滤光片

image.png

光信号手机系统的内圈是长通滤片

image.png

中圈和外圈分别是带通滤片和PMT（啥？）

image.png

刚才细胞经过激光照射会有四个重叠的光谱，x轴是波长，y轴是强度

image.png

光收集系统的过程

第一步，通过长通滤片，光信号被切割

image.png

第二步，经过带通滤片把特定波长的波过滤过来，不符合波长条件的波被反射

image.png

第三步，经过过滤的波，经过PMT转变成电信号，

image.png

1.2.4 PMT当中发生了什么呢

PMT元件是电信号检测分析系统，

image.png

左边是光电转换膜，上下两边有不同的小电极，

image.png

侧边有电子检测器，

image.png

光信号转换成电信号的过程：
光子打到左边的光电转换膜上----> 膜上就会蹦出一个电子，这样就初步实现了光信号转变成电信号 ----> 电信号经过不同的电极就会反弹 ----> 电子经过反弹，电信号实现级联放大作用(通过调整电压可以调整最终的电信号大小) -----> 检测器上就会形成一个电脉冲

image.png

表示电脉冲有三个参数：
峰宽+高度+峰下面积A；
常规的一般用峰下面积A来表示

image.png

下面是经过电信号转换的信号强度值，反映了每个荧光信号的强度；
每一行就是一个细胞，

image.png

怎么转换的呢？

image.png

每一行代表一个细胞，每一列的数值784～10229代表每个特定的PMT的荧光信号强度值；

image.png

两个PMT作为横纵坐标，可以根据荧光强度判定这两种荧光抗体结合细胞的比例；

image.png

点图

image.png

一个细胞在轴上就是一个点，每一个点就代表一个细胞的位置，横纵坐标分别代表两个通道PMT的强度（选取的两个PMT）；
从下图可以看到黑乎乎的一团代表一种细胞，但具体的数字并不知道，为了弥补这个缺点呢，就出现了密度图

image.png

密度图

细胞越多用不同的颜色（伪色）表示，可以看到红色中心的细胞最多，外周细胞少

image.png

等高线图

把密度相等的点画成一条线

image.png

直方图

横轴代表荧光信号强度，纵轴代表细胞数量

image.png

小结

image.png