1 介绍
· 上次练习总结了一下smart seq数据前期分析过程，这次我们来看一下基于10x平台的单细胞测序分析流程
10x测序过程
· 10x技术通过向每个细胞添加barcode（细胞或者凝胶微珠身份证号码）和UMI（每个DNA分子标签的身份证号码）的方式对微滴中的单个细胞进行测序。
2 分析流程
· 对于10x数据来说上游分析一般选用10x公司自带的Cell Ranger,集成比对定量等很多功能，一步分析即可得到表达矩阵，聚类效果，网页版总结等结果以进行后续分析。后续可视化也可以使用10x公司的windows软件Cell Browser查看细胞分群以及细胞表达量等情况。
上游结果文件
Cell Browser可视化输入文件需要.cloupe文件，而后续分析需要使用barcodes.tsv.gz,features.tsv.gz和matrix.mtx.gz这三个矩阵信息。
· 后续分析使用集成R包Seurat可以直接读取10x Cell Ranger结果文件并进行后续分析。
· 牛津大学的Rahul Satija等开发的Seurat，最早公布在Nature biotechnology, 2015，文章是；Spatial reconstruction of single-cell gene expression data , 在2017年进行了非常大的改动，所以重新在biorxiv发表了文章在Integrated analysis of single cell transcriptomic data across conditions, technologies, and species 。功能涵盖了scRNA-seq的QC、过滤、标准化、批次效应、PCA、tSNE亚群聚类分析、差异基因分析、
亚群特异性标志物鉴定等等等。
2 代码展示
首先使用linux环境下的Cell Ranger进行上游分析
2.1 上游分析获得表达矩阵
首先进行构建索引，我们需要准备相应物种的参考基因组fasta序列，以及基因组注释文件gtf/gff3文件。
#一步构建索引
cellranger mkref --nthreads=4 --memgb=16 --genome=chicken --fasta=chicken.fna --genes=chicken.gtf
##--genome指定导出的索引文件夹名称，--fasta参考基因组文件，--genes基因组注释文件
#比对定量
/software/cellranger-3.0.2/cellranger count --id=chicken --fastqs=fastq/chicken/Rawdata/ --sample=CK --transcriptome=ref/chicken/
--localcores=10 --mempercore=10
##--fastqs指定测序文件，--sample指定sample name，--transcriptome指定索引文件路径，--localcores指定cpu，--mempercore内存
CK_S1_L001_R1_001.fastq.gz，CK_S1_L001_R2_001.fastq.gz这里来看一下10x测序文件的命名方式，[sample name]S1_L00[Lane Number][Read Type]_001.fastq.gz。这里sample name指的是CK，Read Type有三种，I1代表cell-barcode，I2代表UMI，R2代表reads。
2.2 后续分析
[数据链接fprw]https://pan.baidu.com/s/1NoSPh1lfKsPOnIwdInWmtg
导入相应软件包
###R版本3.5.1
###Seurat版本3.0
setwd('')
library(Seurat)
library(dplyr)
library(Matrix)
# Load the PBMC dataset
#外周血单个核细胞，是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等
list.files("hg19")
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "hg19")
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1、数据读入
# 创建seurat对象
# 去除掉存在样品数目小于3的基因
# 删除掉那些测到小于200个基因的细胞
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc
An object of class Seurat
13714 features across 2700 samples within 1 assay
Active assay: RNA (13714 features)
###进行一系列的QC步骤##############################
#首先使用PercentageFeatureSet函数计算线粒体基因的百分比
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
#对每个细胞测得的基因，总reads数以及线粒体占比进行展示
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
#随后设定阈值，我们删除小于200，大于2500基因以及线粒体基因占比大于5%的细胞，这个阈值需要具体情况集体分析
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
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根据总体分布设定阈值筛选细胞
2、标准化-normalization
#默认情况下，我们采用全局缩放归一化方法LogNormalize，该方法将每个细胞的特征表达式测量结果与总表达式进行归一化，再乘以比例因子（默认为10,000），然后对结果进行对数转换。
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
pbmc[["RNA"]]@data
#在进行对数标准化之后使用vst方法提取在细胞间变异系数比较大的基因
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
变异系数比较大的基因
3、归一化
#接下来，我们应用线性变换对数据进行缩放，这是像PCA这样的降维技术之前的标准预处理步骤。使每个基因的均值为0，方差为1，具有相同的权重，因此高表达的基因不会占主导地位。
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
pbmc[["RNA"]]@scale.data
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4、PCA线性降维
#接下来，我们对归一化后的数据执行PCA。默认情况下，仅将先前确定的变量特征用作输入。
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
PC_ 1
Positive: MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2
Negative: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL
PC_ 2
Positive: CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1
Negative: NKG7, CST7, PRF1, GZMA, GZMB
PC_ 3
Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1
Negative: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11
PC_ 4
Positive: HLA-DQA1, HIST1H2AC, PF4, CD79B, CD79A
Negative: VIM, IL7R, S100A6, S100A8, S100A4
PC_ 5
Positive: GZMB, NKG7, FGFBP2, GNLY, CCL4
Negative: LTB, IL7R, VIM, AQP3, CYTIP
对PCA分析结果可以进行一系列的可视化： VizDimReduction, DimPlot, DimHeatmap
#绘制每个PC的相关基因
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:6, reduction = "pca")
前两个PC中权重较大的基因
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")
#DimHeatmap可以探索数据集中异质性的主要来源，并且在尝试确定要包括哪些PC以便进行进一步的下游分析时非常有用。基因根据其PC权重排序。设置cells参数会在热图的两端绘制“极端”单元，从而极大地加快了大型数据集的绘制速度。
DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 2500, balanced = TRUE)
PC1中前20个基因的热图展示
#我们还可以指定PC，这样就可以批量可视化不同PC中基因的表达情况，以便快速筛选用于后续分析的PC
DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)
前15个PC的热图展示
对于确定PCA后续分析的维数来说十分重要，我们不能仅仅凭借DimHeatmap的结果简单筛选PC，seurat还设置了碎石图以及肘部图辅助我们筛选PC，通常情况我们应该综合考察情况来决定最终用于后续分析的PC数量。
#主成分分析结束后需要确定哪些主成分所代表的基因可以进入下游分析，这里可以使用JackStraw做重抽样分析。可以用JackStrawPlot可视化看看哪些主成分可以进行下游分析。
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
前15个PC的p值分布与均匀分布
重要的PC将显示出具有较低的p值（虚线上方的实线）。在这种情况下，在前10到12个PC之后，重要性显着下降。
#当然，也可以用最经典的肘图来确定主成分。
ElbowPlot(pbmc)
#这个确定主成分是非常有挑战性的: - The first is more supervised, exploring PCs to determine relevant sources of heterogeneity, and could be used in conjunction with GSEA for example. - The second implements a statistical test based on a random null model, but is time-consuming for large datasets, and may not return a clear PC cutoff. - The third is a heuristic that is commonly used, and can be calculated instantly.
#在本例子里面，3种方法结果差异不大，可以在PC7~10直接挑选。
#seurat鼓励用户使用不同的PC重复进行下游分析，知道寻找到较好的结果，使用10，15，50个PC时最后结果通常没有太大的不同。
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肘图显示在第10个PC左右开始出现转折
5、细胞聚类
#seurat使用的是图聚类的方法，区别于层次聚类以及k-means聚类，首先基于PCA空间中的欧式距离构造一个KNN图，然后基于两个相邻单元在其局部邻域中的共享重叠来计算任意两个单元之间的边缘权重。使用FindNeighbors函数执行此步骤，并将数据集的先前定义的维度（前10个PC）作为输入。使用resolution参数设定聚类时的分辨率。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
head(Idents(pbmc), 5)
## AAACATACAACCAC AAACATTGAGCTAC AAACATTGATCAGC AAACCGTGCTTCCG AAACCGTGTATGCG
## 1 3 1 2 6
## Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
6、运行非线性降维
Seurat提供了几种非线性降维技术，例如t-SNE和UMAP，以可视化和探索这些数据集。这些算法的目标是学习数据的数据特征，以便将相似的细胞放置在低维空间中。上面确定的基于图的聚类中的亚群应该在这些降维图上共定位。作为UMAP和tSNE的输入，作者建议使用相同的PC作为聚类分析的输入。
#Run non-linear dimensional reduction (UMAP/tSNE)
# If you haven't installed UMAP, you can do so via reticulate::py_install(packages =
# 'umap-learn')
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
# note that you can set `label = TRUE` or use the LabelClusters function to help label
# individual clusters
DimPlot(pbmc, reduction = "umap",label = T)
UMAP降维结果
#同样也是一个函数，这个结果也可以像PCA分析一下挑选合适的PC进行下游分析。
pbmc <- RunTSNE(object = pbmc, dims.use = 1:8, do.fast = TRUE)
# note that you can set do.label=T to help label individual clusters
TSNEPlot(object = pbmc,pt.size =3)
#这一步很耗时，可以保存该对象，便于重复，以及分享交流
saveRDS(pbmc, file = "../output/pbmc_tutorial.rds")
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t-SNE降维结果
官网说UMAP聚类效果要好于t-SNE，这里需要注意UMAP需要安装python
7、寻找标记基因
Seurat可以帮助您找到通过差异表达定义聚类的标记。默认情况下，ident.1与所有其他单元格相比，它识别单个簇的正向和负向标记。FindAllMarkers自动执行所有亚群的差异分析过程。
min.pct参数要求在两组亚群中的任何一组中以最小百分比检测特征，而thresh.test参数要求特征在两组亚群之间有所差异。您可以将它们都设置为0，但是时间会大大增加，因为这将测试大量可能不太具有生物学意义的基因。max.cells.per.ident可以设置其他加快这些计算速度的选项，这将降低每个亚群的采样率，。
#Finding differentially expressed genes (cluster biomarkers)
#差异分析在seurat包里面被封装成了函数：FindMarkers，有一系列参数可以选择，然后有4种找差异基因的算法：
#ROC test (“roc”)
#t-test (“t”)
#LRT test based on zero-inflated data (“bimod”, default)
#LRT test based on tobit-censoring models (“tobit”)
# find all markers of cluster 1
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
head(cluster1.markers, n = 5)
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj
S100A9 0.000000e+00 3.786159 0.994 0.215 0.000000e+00
S100A8 0.000000e+00 3.782868 0.971 0.121 0.000000e+00
LGALS2 0.000000e+00 2.561847 0.898 0.061 0.000000e+00
FCN1 0.000000e+00 2.363926 0.953 0.148 0.000000e+00
CD14 4.097329e-294 1.952818 0.662 0.029 5.619077e-290
# find all markers distinguishing cluster 5 from clusters 0 and 3
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj
FCGR3A 1.090652e-202 2.966785 0.988 0.040 1.495720e-198
CFD 3.774787e-188 2.369271 0.938 0.038 5.176743e-184
IFITM3 7.065911e-188 2.675234 0.975 0.052 9.690190e-184
CD68 3.512271e-184 2.093088 0.920 0.035 4.816729e-180
RP11-290F20.3 3.783316e-183 1.898087 0.852 0.017 5.188439e-179
# find markers for every cluster compared to all remaining cells, report only the positive ones
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC)
# A tibble: 20 x 7
# Groups: cluster [10]
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
1 2.25e- 83 0.863 0.455 0.113 3.09e- 79 0 CCR7
2 6.91e- 33 0.757 0.259 0.084 9.48e- 29 0 LDLRAP1
3 0. 3.79 0.994 0.215 0. 1 S100A9
4 0. 3.78 0.971 0.121 0. 1 S100A8
5 4.42e- 82 0.865 0.984 0.646 6.06e- 78 2 LTB
6 1.19e- 57 0.872 0.428 0.114 1.63e- 53 2 AQP3
7 0. 2.98 0.934 0.041 0. 3 CD79A
8 2.92e-275 2.49 0.62 0.022 4.01e-271 3 TCL1A
9 1.84e-191 2.11 0.619 0.054 2.52e-187 4 GZMK
10 2.19e-190 2.03 0.957 0.238 3.00e-186 4 CCL5
11 5.03e-192 2.31 0.988 0.132 6.89e-188 5 FCGR3A
12 1.07e-125 2.09 1 0.314 1.46e-121 5 LST1
13 4.93e-269 3.38 0.986 0.071 6.77e-265 6 GZMB
14 1.41e-177 3.40 0.959 0.134 1.93e-173 6 GNLY
15 1.61e- 7 0.872 0.128 0.423 2.21e- 3 7 CAP1
16 1.01e- 3 1.05 0.103 0.263 1.00e+ 0 7 NDUFA2
17 1.19e-266 2.66 0.833 0.009 1.63e-262 8 FCER1A
18 2.53e- 23 1.93 1 0.507 3.47e- 19 8 HLA-DPB1
19 1.32e-181 4.94 0.933 0.011 1.82e-177 9 PF4
20 2.61e-117 5.87 1 0.024 3.58e-113 9 PPBP
##每一个cluster中top2差异基因
#值得注意的是： The ROC test returns the ‘classification power’ for any individual marker (ranging from 0 - random, to 1 - perfect).
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25, test.use = "roc", only.pos = TRUE)
#######################################################
#同时，该包提供了一系列可视化方法来检查差异分析的结果的可靠性：
#VlnPlot (shows expression probability distributions across clusters)
#FeaturePlot (visualizes gene expression on a tSNE or PCA plot) are our most commonly used visualizations
#JoyPlot, CellPlot, and DotPlot
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
# 我们也可以使用raw counts进行绘制
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)
FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP",
"CD8A"))
#DoHeatmap generates an expression heatmap for given cells and genes. In this case, we are plotting the top 20 markers (or all markers if less than 20) for each cluster.
检查每个亚群的标记基因
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
热图展示每个亚群前十个标记基因
8、定义亚群
我们可以根据先验知识进行亚群的定义，也可以使用一些软件包例如singleR辅助我们进行亚群的定义。
#通过先验知识对细胞亚群进行划分，使用RenameIdents参数替换亚群名称。
new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "Memory CD4 T", "CD14+ Mono", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono",
"NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 1) + NoLegend()
2.3 伪时间序列分析
################################monocle###################################################################
################################monocle#############################################################
##########################################################################################################
##伪时间分析
#加载程辑包：
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("monocle")
library(monocle)
##1、数据导入
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, min.cells = 3, min.features = 200,
project = "10X_PBMC")
pbmc
#spleen_monocle <- importCDS(seurat_lung, import_all = TRUE)
data <- as(as.matrix(pbmc@assays$RNA@counts), 'sparseMatrix')
pd <- new('AnnotatedDataFrame', data = [email protected])
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
fd <- new('AnnotatedDataFrame', data = fData)
#Construct monocle cds
clustered_spleen_monocle <- newCellDataSet(data,
phenoData = pd,
featureData = fd,
lowerDetectionLimit = 0.5,
expressionFamily = negbinomial.size())
head(pData(clustered_spleen_monocle))
orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA Size_Factor
AAACATACAACCAC 10X_PBMC 2419 779 NA
AAACATTGAGCTAC 10X_PBMC 4903 1352 NA
AAACATTGATCAGC 10X_PBMC 3147 1129 NA
AAACCGTGCTTCCG 10X_PBMC 2639 960 NA
AAACCGTGTATGCG 10X_PBMC 980 521 NA
AAACGCACTGGTAC 10X_PBMC 2163 781 NA
names(pData(clustered_spleen_monocle))[names(pData(clustered_spleen_monocle))=="res.0.6"]="Cluster"
clustered_spleen_monocle <- estimateSizeFactors(clustered_spleen_monocle)
clustered_spleen_monocle <- estimateDispersions(clustered_spleen_monocle)
HSMM<-clustered_spleen_monocle
## 归一化
HSMM <- estimateSizeFactors(HSMM)
HSMM <- estimateDispersions(HSMM)
#Filtering low-quality cells
HSMM <- detectGenes(HSMM, min_expr = 3 )
print(head(fData(HSMM)))
gene_short_name num_cells_expressed
AL627309.1 AL627309.1 0
AP006222.2 AP006222.2 0
RP11-206L10.2 RP11-206L10.2 0
RP11-206L10.9 RP11-206L10.9 0
LINC00115 LINC00115 0
NOC2L NOC2L 1
expressed_genes <- row.names(subset(fData(HSMM),num_cells_expressed >= 10))
print(head(pData(HSMM)))
orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA Size_Factor num_genes_expressed
AAACATACAACCAC 10X_PBMC 2419 779 1.1204557 126
AAACATTGAGCTAC 10X_PBMC 4903 1352 2.2710187 181
AAACATTGATCAGC 10X_PBMC 3147 1129 1.4576577 149
AAACCGTGCTTCCG 10X_PBMC 2639 960 1.2223574 153
AAACCGTGTATGCG 10X_PBMC 980 521 0.4539258 34
AAACGCACTGGTAC 10X_PBMC 2163 781 1.0018791 103
#细胞分类（Classifying）
CDC20 <- row.names(subset(fData(HSMM), gene_short_name == "CDC20"))
GABPB2 <- row.names(subset(fData(HSMM),gene_short_name == "GABPB2"))
cth <- newCellTypeHierarchy()
cth <- addCellType(cth, "CDC20", classify_func =
function(x) { x[CDC20,] >= 1 })
cth <- addCellType(cth, "GABPB2", classify_func = function(x){ x[GABPB2,] >= 1 })
HSMM <- classifyCells(HSMM, cth, 0.1)
table(pData(HSMM)$CellType)
#Clustering cells without marker genes
#红线表示单片基于这种关系对色散的期望。我们标记用于聚类的基因用黑点表示，其他的用灰点表示。
disp_table <- dispersionTable(HSMM)
unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)
HSMM <- setOrderingFilter(HSMM, unsup_clustering_genes$gene_id)
plot_ordering_genes(HSMM)
# Plots the percentage of variance explained by the each component based on PCA from the normalized expression data using the same procedure used in reduceDimension function.
# HSMM@auxClusteringData[["tSNE"]]$variance_explained <- NULL
plot_pc_variance_explained(HSMM, return_all = F) # norm_method='log'
HSMM <- reduceDimension(HSMM, max_components = 2, num_dim = 10,reduction_method = 'tSNE', verbose = T)
#Remove noise by PCA ...
#Reduce dimension by tSNE ...
HSMM <- clusterCells(HSMM, num_clusters = 2)
#Distance cutoff calculated to 2.589424
plot_cell_clusters(HSMM, 1, 2, color = "CellType",markers = c("CDC20", "GABPB2"))
##降维
HSMM <- reduceDimension(HSMM, max_components = 2,
method = 'DDRTree')
# 将细胞按照伪时间排序
clustered_spleen_monocle<-HSMM
clustered_spleen_monocle <- orderCells(clustered_spleen_monocle)
colnames(pData(clustered_spleen_monocle))
plot_cell_trajectory(clustered_spleen_monocle, color_by = "Cluster")
plot_cell_trajectory(clustered_spleen_monocle, color_by = "CellType")
plot_cell_trajectory(clustered_spleen_monocle, color_by = "State")