终于把CRISPR-Cas9基因编辑系统这篇文章看完个大概了。

Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system

这篇文章真的看了好久，就算一开始秉承着不求甚解的精神都看不下去，有太多的专业背景需求，直到昨天做完了T7 Endonuclease I digestion实验，回过头再来看这篇protocol文章，终于能明白了百分之七八十了。

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但这篇文章长达29页，实在是不适合一页一页的翻看，看到后面前面已经忘记了，所以今天我将这篇文章的框架摘抄出来，整理如下：

ABSTRACT--略

INTRODUCTION--5个小标题

1. Precise genome editing using engineered nucleases

简单的背景介绍，说明精确编辑的重要性，有什么样的核酸酶。

2. Cas9: an RNA-guided nuclease for genome editing

详细介绍Cas9，并且介绍sgRNA。

3. Comparison with other genome editing technologies

简单的对比一下不同的基因编辑工具的优缺点，突出CRISPR-Cas9的优点

4. Limitations of the Cas9 system

简述CRISPR-Cas9的缺点

5. Experimental design

终于到实验设计部分了

(1) Target selection for sgRNA.

先确定要干嘛（敲除还是编辑），然后设计sgRNA

(2) Approaches for sgRNA construction and delivery.

确定sgRNA的表达方式，既然Cas9是需要sgRNA帮助来识别靶点的，那么sgRNA在细胞内该如何产生呢？这里提供了两种办法，PCR扩增法还有质粒表达法。

(3) Design of repair template.

这部分是设计模板，HDR（同源修复）有两种模板，一种是我们设计好插入到质粒中，另外一种呢是ssODN。想清楚选择哪一种。

(4) Clonal isolation of cell lines.

将带sgRNA表达的质粒或者载体+模板一起转染细胞，并且最后通过筛选标记分离（抗生素抗性或者荧光筛选）。

(5) Functional testing.

验证基因编辑的效果。

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MATERIALS--实验材料和试剂

1. REAGENTs

sgRNA preparation, Mammalian cell culture, genotyping analysis

2. REAGENT SETUP

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PROCEDURE--实验步骤

1. 确定要用什么材料，sgRNA还是ssODN

一般来说 sgRNA是帮助Cas9识别靶点，而Cas9造成DNA的双剑断裂（DSB）切口之后，DNA需要自我修复（DNA总不能一直断着吧）。

这时候呢，没有模板的就是易出错的同源修复，会造成缺失（敲除），那么有模板的呢，这部分模板就会接上去，就造成了插入，这就是我们常说的HDR。

那么说到HDR是需要模板的，模板又分为两种，一种呢是在质粒上的，另一种比较简单，是ssODN。

因此，首先要确定的是，到底是想做敲除呢，还是想做插入。

1.1 Design of targeting components and the use of the CRISPR Design Tool ● TIMING 1 d

1.2 Design of the ssODN template (optional) ● TIMING 1 h

2. 确定好之后开始action

Preparation of sgRNA expression construct，因为我们要做的是敲除，并且选择了质粒sgRNA的方法，所以首先要设计sgRNA，并将sgRNA插入到质粒中

(A) Generation of the sgRNA expression construct by PCR amplification ● TIMING 2 h

(B) Cloning sgRNA into the pSpCas9(BB) vector for co-expression with Cas9 ● TIMING 3 d

3. 功能测试

第一部分自然是先转染细胞，将材料都转进去。

Functional validation of sgRNAs: HEK 293FT cell culture and transfections ● TIMING 3–4 d** 先拿293FT细胞做转染验证

Co-transfection of CRISPR plasmids and HDR templates into HEK 293FT cells (optional) ● TIMING 3–4 d** 这是我们前面提到的，如果要做HDR修复的话，那就需要模板，需要将质粒和模板共转。

hESC (HUES 9) culture and transfection ● TIMING 3–4* 因为多能干细胞和普通细胞的转染是不一样的，所以单独放出来给大家参考。

第二部分就是我们说的筛选细胞

Isolation of clonal cell lines by FACS ● TIMING 2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通过荧光筛选细胞的实验步骤。

Isolation of clonal cell lines by dilution ● TIMING 2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通过挑单克隆的方法筛选

第三部分就是编辑效果

Functional testing: detection of indel mutations by the SURVEYOR nuclease assay ● TIMING 5–6 h 通过SURVEYOR核酸酶实验验证效果，这部分我没有用这个酶，我们用的是T7 Endonuclease I，这个酶可以识别DNA上错配的地方，然后给切开。

Functional testing: detection of genomic microdeletions by PCR ● TIMING 3–4 h hands-on; 2–3 weeks expansion 通过PCR实验验证删除和倒置。
(A) Deletion or microdeletion analysis
(B) Inversion analysis

Functional testing: genotyping of HDR-mediated targeted modifications by restriction-fragment length polymorphism (RFLP) analysis ● TIMING 3–4 h 限制性片段长度多态性验证HDR介导的基因编辑结果。这个名词好长，看起来不好理解，实际上就是，不好理解。可以自行百度一下就知道了。

Assessment of Cas9 cleavage or HDR-mediated target modification efficiency by Sanger sequencing ● TIMING 3 d 测序验证

Deep sequencing and off-target analysis ● TIMING 2–3 d 脱靶效应

总览

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思路图

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其实中间还漏了一个质粒转化、扩增和鉴定的过程。