【每周文献】2019.08.05-2019.08.11

1.R蛋白的开关平衡 2016-Plant Cell

R蛋白的开关平衡 2016-Plant Cell

本文以亚麻不同R蛋白allele为切入点，鉴定到了TIR domain和NB-ARC domain中调控R蛋白活性的位点。并进一步发现激活的R蛋白更易结合ATP，而活性降低的R蛋白则更倾向于结合ADP。另外，和ATP结合的蛋白和effector结合得也更紧密。本文进一步验证了R蛋白可作为分子开关，通过和ATP/ADP的结合，调节植物免疫的模型。

Take Home Message：

1. 提取酵母蛋白方法： postalkaline extraction method

Kushnirov, V.V. (2000). Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast 16: 857–860.

2. R蛋白的体外表达比较困难，本文使用酵母表达。并且使用从酵母中纯化的R蛋白直接检测蛋白结合的酵母内源的ATP/ADP，这应该属于半体内实验。

3. 检测ATP/ADP含量，ATPase活性的相关试剂盒

腺苷 5′-三磷酸（ATP）生物发光测定试剂盒 ：Sigma, 货号：FLAA-1KT

二磷酸腺苷（ADP）检测试剂盒（比色法/荧光法）：sigma，货号：MAK033-1KT

ADP/ATP 比率检测试剂盒：sigma，货号：MAK135-1KT

ATP酶/GTP酶活性检测试剂盒：sigma，货号：MAK113-1KT

2. NALP3结合ATP诱导炎症反应 2007-PNAS

NALP3结合ATP诱导炎症反应 2007-PNAS

Cryopyrin参与动物多聚炎症复合体的形成，属于nucleotide-binding蛋白家族。本文通过亲和色谱法，纯化到了Cryopyrin蛋白全长，证明Cryopyrin可以结合ATP并具有ATPase的活性。当P-loop上的保守位点突变后导致不能结合ATP，影响自我互作，以及和下游互作蛋白的互作，最终不能诱发炎症反应。

本文说明了Cryopyrin这类蛋白的核酸结合活性对其功能的行使是非常重要的。另外，自我互作以及和其他蛋白的互作也是行使正常功能所必需的。

Take Home Message：

1. 证明ATP结合活性的实验：ATPγS结合，竞争实验，ATP-agarose结合

ATPγS：腺苷5′-(β,γ-硫代)三磷酸盐 锂盐 水合物，sigma，A2647-5MG

ATP-agarose：sigma，A4793-1ML

ADP-agrose：sigma，，A3515-5ML

2. 和植物中的R蛋白类似，这类蛋白自我互作形成寡聚体或多聚体可能非常重要，而且核酸结合活性可能对这一过程影响非常大。

3.effector诱导R蛋白寡聚化 2006-PC

effector诱导R蛋白寡聚化 2006-PC

本研究发现，elicitor会诱导R蛋白的寡聚化（自我互作），而且这种寡聚化依赖于elicitor。P-loop突变后，elicitor无法诱导R蛋白的寡聚化，说明P-loop在elicitor诱导的寡聚化中非常重要。P-loop会影响R蛋白和ATP/ADP的结合，这也从侧面说明了结合ADP/ATP会影响R蛋白的寡聚化。

Take Home Message：

将R蛋白连接不同的tag，使用Co-IP检测R蛋白是否可以寡聚化。