转录组入门三（mac 版）：了解fastqc测序数据

作业要求

需要用安装好的sratoolkit把sra文件转换为fastq格式的测序文件，并且用fastqc软件测试测序文件的质量！
作业，理解测序reads，GC含量，质量值，接头，index，fastqc的全部报告，搜索中文教程，并发在论坛上面。
来源于生信技能树：http://www.biotrainee.com/forum.php?mod=viewthread&tid=1750#lastpost

实验步骤

1. 将 sra 数据转化成 fastq 格式

先建立一个SRR_fastqc.sh 文件，写入代码

#!/usr/bin/env bash
for i in {56..62}
do
fastq-dump --gzip --split-3 -O /Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files -A SRR35899${i}.sra
done

• --gzip 压缩格式为gzip
• --split-3 如果是双端测序输出两个文件，如果不是只输出一个文件
• -0 输出文件路径
• “/Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files” 这里改成你自己的文件路径
• -A 输入文件路径

2. 在终端运行

# 这一步很慢，我跑了2小时，泡杯咖啡，欣赏一部电影吧
$ bash SRR_fastqc.sh 

image.png

3. fastqc 检测测序文件质量

创建一个文件夹

mkdir fastqc/

创建一个fastqc.sh脚本，写入如下代码

#!/usr/bin/env bash
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589956_1.fastq.gz SRR3589956_2.fastq.gz
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589957_1.fastq.gz SRR3589957_2.fastq.gz
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589958_1.fastq.gz SRR3589958_2.fastq.gz
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589959_1.fastq.gz SRR3589959_2.fastq.gz
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589960_1.fastq.gz SRR3589960_2.fastq.gz
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589961_1.fastq.gz SRR3589961_2.fastq.gz
fastqc -o ./fastqc/ -t 8 SRR3589962_1.fastq.gz SRR3589962_2.fastq.gz

• -o: 输出路径
• -t: 线程数，和电脑配置有关，每个线程需要250MB 的内存

bash fastqc.sh

image.png

4. 质量解读

html 格式用浏览器打开

基本信息

• Enconding: 测序平台版本号
• Total Sequence: reads 的数量
• Sequence length: 总的序列数

• %GC GC比，这个指标有物种意义，用于区别物种，一般人类42%

  
  
  

  image.png

每个read各位置碱基的测序质量

• 横轴碱基的位置（1-51），纵轴是质量分数，20表示1%的错误率，30表示0.1%
• 红色线代表中位数，蓝色代表平均数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间
• Warning 报警 如果任何碱基质量低于10,或者是任何中位数低于25
• Failure 报错 如果任何碱基质量低于5,或者是任何中位数低于20

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偏离度

• 横轴碱基的位置（1-51）
• 纵轴是tail的Index编号
• 检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，蓝色代表偏离度小，质量好，越红代表偏离度越大，质量越差。

• 这个图主要是为了防止，在测序过程中，某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低

  
  
  

  image.png

reads质量的分布

• 横轴表示Q值，0-40
• 纵轴是每个值对应的reads数目
• 当峰值小于27时，警告；当峰值小于20时，fail。我的报告峰值在38

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GC 含量统计

• 横轴碱基的位置（1-51）
• 纵轴是碱基含量百分比
• 图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量
• 当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。
• 本结果前10个位置，每种碱基频率有明显的差别，说明有污染。
• 当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"WARN"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"FAIL"

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序列平均GC含量分布图

• 横轴是百分比； 纵轴是每条序列GC含量对应的数量

• 蓝色的线是程序根据经验分布给出的理论值，红色是真实值，两个应该比较接近才比较好

• 当红色的线出现双峰，基本肯定是混入了其他物种的DNA序列

• 偏离理论分布的reads超过15%时，报"WARN"；偏离理论分布的reads超过30%时，报"FAIL"

  
  
  

  image.png

各位置N的reads比率

• 当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率
• 正常情况下，N值非常小
• 当任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；当任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"

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reads 长度分布

• 每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的
• 当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报“FAIL”
• 当测序的长度不同时，如果很严重，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信

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统计不同拷贝数的reads的频率

• 横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目,以unique reads的总数作为100%

• 测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在

• 当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL"

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接头含量

• 此图衡量的是序列中两端adapter的情况
• 如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计
• 本例中adapter都已经去除，如果有adapter序列没有去除干净的情况，在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头

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重复短序列

• 这个图统计的是，在序列中某些特征的短序列重复出现的次数
• 我们可以看到1-8bp的时候图例中的几种短序列都出现了非常多的次数，一般来说，出现这种情况，要么是adapter没有去除干净，而又没有使用-a参数；要么就是序列本身可能重复度比较高，如建库PCR的时候出现了bias

• 对于这种情况，我的办法是可以cut掉前面的一些长度，可以试着cut 1bp

  
  
  

  image.png

参考文献

1. http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ2irG2836uQYm2iZAyh1Zwf3_ （青山屋主）
2. www.biotrainee.com/thread-2034-1-1.html (laofuzi)
3. http://www.jianshu.com/p/14fd4de54402 （lxmic）
4. https://zhuanlan.zhihu.com/p/20731723 (孟浩巍)