羧酸荧光染料及其琥珀酰亚胺酯（转载）

琥珀酰亚胺酯(SE或NHS)已被证明是最好的氨基修饰试剂，因为它与氨基形成的酰胺键与天然蛋白中的酰胺键一模一样。Dye-SE与脂肪胺具有很高的反应活性。Dye-SE与生物分子连接须考虑以下因素的影响。

1. 溶剂:大多数情况下，应该溶解在无水DMF或DMSO中，特别是对非水溶性染料。

2. 反应 pH:Dye-SE与非质子化的脂肪胺的反应受pH影响较大，一般反应 pH>7.5。蛋白的修饰经常在pH 7.5～8.5进行。

3. 反应缓冲溶液:不能使用含有自由氨基的缓冲溶液。铵盐(例如硫酸铵和醋酸铵等常用的蛋白沉淀剂例如runngngrongye)在标记前也必须除去。

4. 反应温度:一般在常温或4℃进行标记反应。

以下标记步骤仅供参考，客户可根据自己的情况进行优化。

Dyes-SE标记蛋白

1. 将 1 mg NHS-ester Dyes 溶解在 50 μL无水并且不含氨基的 DMF中 (最终浓度大约25 nmol·μL-1)得到工作液。

2. 将标记的蛋白溶解在碳酸氢钠缓冲液中(pH 9.0, 50 mM)。

3. 将一定量的 NHS-ester Dyes 工作液滴定到蛋白的缓冲溶液中常温反应1小时以上。因为NHS-ester Dyes反应活性很高，2倍蛋白摩尔量的NHS-ester Dyes 得到的F/P=1～2。过量标记会影响蛋白活性并降低量子产率。

4. 用Sephadex column (Sephadex G25 medium; eluent PBS pH 7.2, 22 mM)分离标记蛋白，通常第一个流出色带就是标记蛋白。

Dyes-SE标记抗体

1. 带标记的抗体应该先经过Protein A- 或 Protein G-Sepharose柱子纯化，抗体浓度至少1 mg/mL，体积在0.5～2 mls。

2. 标记前先将抗体在0.1 M sodium bicarbonate buffer pH 8.5 透析4小时。

3. 将Dye-NHS ester溶解在无水DMSO 浓度1 mg/mL。Dye-NHS ester易水解，其溶液最好现用现配，DMSO中可加入少量分子筛除水。

4. 将抗体从透析液中转入1.5 mL Eppendorf 管中，轻轻摇动，每毫升抗体中缓慢加入125 μL NHS ester工作液，室温反应4小时。(这时抗体和Dye-NHS ester重量比是8:1 w/w。客户可根据自己的条件，按此在4:1～10:1之间调整最佳比例。)

5. 将反应液在1000倍的PBS pH 7.4 缓冲液中4℃透析以除去未反应的Dye，必要时过柱子纯化，一般第一个流出色带就是标记抗体。