SimLipid：一种高通量信息学工具

利用LC-, MALDI-, Shotgun-, Mass Spectrometry Workflows中的数据识别和相对定量脂质的高通量信息学工具

脂质的主要生物学功能包括能量储存、作为细胞膜的结构成分、作为重要的信号分子参与。

对细胞和组织中复杂脂质混合物的比较研究可能揭示脂质生物标志物。膜中脂质的存在反映了生物体在一定时间内的生理状态。这些研究采用了基于色谱和质谱的靶向和非靶向方法。这两种方法都涉及到样品中脂质的鉴定和测量。

基于质谱的脂质组学面临的挑战是生物样品中存在的数千种脂质的化学复杂性和大浓度范围。此外，脂质的鉴定需要复杂的软件，因为与DNA、碳水化合物或肽等其他生物聚合物相比，脂质MS/MS谱的自动解释更具挑战性，因为脂质显示的标准化片段质谱要少得多。每个类脂都有自己的裂解模式和电离效率。

Simlipid是一款高通量的脂质识别和定量软件。它可以处理数百个LC-MS和MS/MS实验运行的原始数据，用于LC峰检测、峰拾取、分子特征发现和保留时间比对。原始数据或峰值列表（包含处理过的LC-MS数据的数据集）可以通过MS和MS/MS数据库搜索结构说明，甚至在批处理模式下也是如此。专有的评分机制为每个MS/MS扫描区分等压候选结构。SimLipid数据库包含40312种脂类，以及硅MS/MS特征离子中特有的1508293种结构。此外，该数据库还存储了5227个前体离子扫描和中性损失扫描三重四极质谱方法的转换，分别对应于来自甘油磷脂、甘油脂和鞘脂的1179393和221个独特脂肪酰。

最后，对于已识别的峰，可以在批处理模式下对实验峰强度（其同位素重叠）进行校正。也可以根据用户指定的内部标准对轮廓脂质进行相对量化。

该软件通过搜索观察到的前体和产物离子、保留时间和其他基于分类法的过滤器，根据SimLipid数据库中的已知脂质结构，实现脂质识别和分析。还提供了其他信息，如脂质ID、脂质缩写、系统名称、组成和其他数据库链接，以供参考。

图1:Simlipid软件的示意图，用于使用直接注入和LC质谱法的数据对脂质进行结构鉴定。

SimLipid的功能

强健的脂质结构数据库

SimLipid数据库是一个可扩展的关系数据库，包含9个类脂，即肉碱、脂肪酰、甘油脂、甘油磷脂、聚酮类、丙烯醇、糖脂、鞘脂和甾醇。该数据库存储了40312种脂类和1508293种硅质质谱/质谱特征离子特有的结构。此外，该数据库还存储了5227个前体离子扫描和中性损失扫描三重四极质谱方法的转换，分别对应于1179、393和221个来自甘油磷脂、甘油脂和鞘脂的独特脂肪酰。

用户可以创建自定义数据库*来存储整理过的脂质以及保留时间和漂移时间。创建自定义数据库后，可以使用保留时间和漂移时间公差作为初始搜索谓词来执行MS和MS/MS数据库搜索，以确定脂质的结构。此功能有助于用户创建LC-MS或LC-Ion Mobility-MS模板；从而使他们能够利用最先进的LC-MS和IMS技术进行研究。

其他数据库链接包括京都基因和基因组百科全书（KEGG）、人类代谢组数据库（HMDB）、生物感兴趣的化学实体（CEBI）、PubChem Substance数据库、LIPIDBANK和LIPIDAT。数据库正在不断更新中。

图1:SimLipid数据库的示意图。

请注意：*该功能在此软件的Enterprise版中提供。

项目管理与数据可视化

SimLipid提供了一个全面的项目管理，将脂质分析结果与输入配置文件和搜索参数相关联。您可以创建任意数量的项目。您还可以在批处理模式中导入数百个原始数据文件。实验MS运行的完整原始数据：总离子色谱图、鉴定的脂质、MS或MS/MS光谱及其相应的数据库信息显示在一个工作台上。

图2: SimLipid软件的典型图形用户界面：单一工作台，使您能够可视化LC-MS、ESI-MS、MALDI-MS实验扫描的完整原始数据、执行数据库搜索后的结果以及识别出的脂质的相应信息。

SimLipid提供以下附加功能：

1. 对应于指定的保留时间窗口和/或前兆m/z范围的平均MS和MS/MS扫描。

2. 根据所支持的文件格式，根据前体离子m/z、电荷状态、保留时间、强度和漂移时间对加载的数据集进行排序。

3. 识别脂质的扫描/光谱用颜色编码，旁边显示识别脂质的名称/缩写/分子式。

4. 查看目标m/z的提取离子色谱图。

高通量MS脂质搜索

SimLipid通过搜索脂前体离子与SimLipid数据库中已知的脂肪结构（肉碱、脂肪酰、甘油脂、甘油磷脂、聚酮、Prenols、糖脂、鞘脂和甾醇）进行比较，从多个MS峰值列表数据中实现高通量脂谱分析。用户可以执行MS脂质搜索的高分辨率数据，误差容限小于或等于50 ppm或2000 milliDalton (mDa)。SimLipid在正离子模式下支持[M+H], [M+NH4], [M+Na], [M+C5H12N], [M+Li]离子，在负离子模式下支持[M-H], [M+AcO], [M+Cl],[M-CH3], [M+OAcO]和[M+HCOO]。用户还可以从MS脂质图谱中触发产品离子数据分析。对应于前体m/z的异形脂质可以用候选脂质物种的产物离子数据来验证。

用户可以从m/z值和对应的离子种类的预定义列表中导入已经包含在高通量搜索中的前体m/z值的离子种类。这有助于在可变离子模式和不同加合物中进行MS/MS搜索。根据保留时间、前驱体m/z和强度，有多种选项可用于选择要包含在批量运行中的MS和MS/MS配置文件。

利用MS/MS和MS^E数据进行高通量脂质结构分析

SimLipid支持利用肉碱、脂肪酰、甘油脂、甘油磷脂、丙烯醇、糖脂、鞘脂和甾醇的MS/MS和MSE光谱的前体和产物离子m/z数据对脂质进行结构说明。识别出的脂质基于一种创新的排序算法进行评分，该算法指示理论脂质与实验数据的相对接近程度。可以分析误差在0.00～1百万分之一（ppm）和0.1～2000毫达顿（MDA）之间的高精度准确质量数据。

多重前体离子扫描（PIS）和中性损失扫描（NLS）三重四极质谱脂质谱分析方法

来自多个PIS/NLS的数据可以使用本地文件格式或标准格式导入SimLipid软件。用户可以通过根据生物/技术复制对数据文件进行分类来模拟SimLipid的实验设计。基于目标脂肪酰/头基片段离子或其中性损失的脂质鉴定以批处理模式进行。

SimLipid能够根据MS光谱上观察到的峰对脂质进行量化。量化是通过基于所选内标的观测强度对强度值进行标准化来完成的。该计划促进了内源性/外源性脂质作为内部标准的规范化。为了能够从低分辨率光谱定量脂类，SimLipid修正了同位素重叠的强度。这有助于从生物混合物中准确定量脂质。量化数据连同其他信息，如峰值m/z，分子公式，校正，未校正和归一化强度在不同的样本可以导出到一个兼容.csv和.xls格式的电子表格。

图3：使用MPIS/NLS QqQ MS方法数据的SimLipid软件脂质分析和定量工作流程示意图。

LCMS和LC- MS/ MS高通量数据处理

SimLipid处理LC-MS和MS/MS数据，用于峰检测、平滑、色谱反褶积、峰分离和分子特征发现。该程序将检测到的峰m/z值与相应的MS/MS光谱对齐，从而能够使用来自MS和MS/MS数据的前体和产物离子数据无缝识别脂质结构。

SimLipid也有助于比较和定量分析从不同生物样品中鉴定出的脂质。利用RANSAC技术，根据保留时间、m/z值、观察强度和电荷状态的一致性，对不同峰表中的峰进行排列。多达200个峰值列表可以对齐，结果可以导出到HTML、CSV和MS Excel格式。

SimLipid软件提供LC-MS峰列表的单一工作台视图；实验LC-MS运行中已识别脂质的列表；特定保留时间下已识别脂质的结构；数据库中已识别脂质的相关信息；总离子色谱图，在所鉴定的脂质的保留时间用竖条表示。

图4:SimLipid软件的典型图形用户界面：LC-MS峰值列表的单一工作台视图，保留时间点的已识别脂质列表，选定保留时间点的脂质结构，以及带有指示保留时间的垂直线的样品色谱图显示脂质结构的点。

脂质质谱注释

SimLipid用脂类注释质谱，并为MS, MS/MS和MS^E数据识别片段离子。这有助于解释质谱，突出了与产品数据库中理论脂质结构匹配的实验m/z值。

注释的质谱可以被判断/重新调整大小以适合于页面或基于感兴趣的区域。用户可以使用鼠标光标或指定M/Z范围放大/缩小到特定的绘图位置。此外，用户可以输出注释谱作为图像（在PNG和JPEG格式）中可以包括在MS PowerPoint中，促进研究组之间的信息共享。

图5: SimLipid软件的典型图形用户界面：已识别脂质TG的注释MS/MS光谱（56:3）。光谱中观察到的两个最强烈的峰分别对应于结构独特的脂肪酸链的特征离子18:1和20:1。

生成报表

在分析质谱数据之后，用户可以从HTML、CSV和MS Excel格式生成目标导向报告，从50000毫秒和MS/MS配置文件。用户可以设置SimLipid，在执行分析后自动启动报告。可以生成的报告是：

• 异形MS谱：生物标志物研究中可以产生的分析脂质在不同生物样品中的丰度的比较分析。

• MS和MS/MS数据：报告显示了与MS搜索中通常遇到的前体M/Z值相对应的假阳性，以及在产品离子数据分析期间识别的脂质的概率得分。这种报告是通过结合MS脂质谱及其补充MS/MS或MS^E脂质谱生成的。

• 多个数据集：一份报告，包含不同离子模式和加合物中获得的不同质谱或质谱/质谱谱的脂质对比分析。

• 保留时间：本报告使用户能够通过根据保留时间对齐MS/MS曲线，调查在可变离子模式下获得的MS/MS光谱中观察到的碎片离子。这提供了一个完整的工作流程解决方案，以确定未知脂质的结构，这些脂质属于GP、SP和GL等类别，其中在负谱中观察到与脂肪酸链相对应的诊断离子，而在正谱中观察到与头部相对应的诊断离子。

  
  

图6：使用导出到MS Excel文件中的MS/MS数据识别脂质。

数据库搜索

您也可以通过脂质缩写/普通名称、质量、化学成分或脂质ID来寻找感兴趣的脂质结构。

SimlipidEnterprise版

现在提供了SimLipid的Enterprise版。如果您使用的是私有自定义数据库或私有数据，那么企业版是您正在寻找的解决新脂质的安全工具。您可以从数据库中添加或删除脂类结构，或者创建自己的子数据库来缩小搜索范围，从您的工作站的方便性出发。多个脂质的结构信息可以存储在单个文件中并添加到数据库中，节省时间。

当您购买Enterprise版时，您会得到：

• Windows支持SimLipid客户端。

• 客户端和数据库的智能更新程序。

• 在Windows服务器上支持SimLipid数据库和数据库搜索引擎。

• 用户管理和备份系统。

• 为3个用户设置。

• 无限的技术支持。

Simlipid版本6.05发布

新版本包括以下增强功能：

• 改进的DDA数据峰值拾取算法：SimLipid现在采用了一种新的峰值拾取算法，在加载串联MS数据（使用DDA方法获得）时，精确分配MS/MS扫描的前兆M/Z值。对于MS/MS s光谱的前驱体m/z值，SimLipid从MS1数据中识别包含前驱体m/z的同位素簇，然后将单同位素峰的m/z指定为MS/MS扫描的前驱体m/z，从而能够准确识别脂质物种。

• LC-MS和（DIA）MS/MS实验的高通量数据分析工作流程：SimLipid处理LC-MS和MS/MS原始数据，使用数据独立采集（DIA）方法采集，准确检测峰值并将产物离子与其前体离子关联。然后，此软件根据保留时间、m/z值、观察到的强度和电荷状态的一致性，对从不同峰值列表中检测到的峰值进行对齐。峰值或对齐的峰值可以进一步进行MS/MS数据库搜索，以准确地识别批处理模式下的脂质结构。

• 基于HRMS的脂质体分析：基于HRMS的脂质体分析工作流程的自动化实验设计建模，包括MS1数据平均和跨生物和技术复制的m/z峰对齐。

• 频率表和图表：SimLipid现在包括一个直观的图形解释，使用饼图和条形图对基于LC-、MALDI、Shotgun-、MS和MS/MS的实验运行的脂质分布进行解释。现在，使用频率表方便地对不同样本的脂质分布进行比较分析。

• 统计分析：导出LC-MS和MS/MS数据库检索结果到CSV格式文件，可直接导入MetaboAnalyst#或MetaboScape*软件进行下游统计分析。

• 导出结果：基于过滤标准，如Score和Matched RI，用户可以输出独特的脂质ID连同保留时间、四极位置（bin）/漂移时间和离子种类信息到MS Excel或CSV文件格式。

• 创建LC-MS和Shotgun-MS模板**：现在，SimLipid有助于直接导入Shotgun-MS和LC-MS工作流程生成的报告，以便创建可用于MS / MS搜索阐明脂质的自定义数据库。

• Waters MassLynx UHPLC-MS^E.raw文件中直接导入原始数据：SimLipid现在可以直接从Waters MassLynx UHPLC-MSE .raw文件导入原始数据（质心和锁定质量校正）。

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