Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡的原理与注意事项

Annexin

V检测细胞凋亡的原理正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡的早期，细胞膜内的PS会从内侧翻转到细胞膜表面。

Annexin

V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的，对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核染上。

因此Annexin

V 和PI同时使用，可以将凋亡早期的细胞与其它细胞区别开来。细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色）检测的实验步骤：细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色）适用于：细胞未转染GFP或未使用红色药物。

1

．收集细胞：包括漂浮在培养基上的细胞；之后，须把EDTA洗去，PBS或培养基重悬送样，正常组细胞分出200μl体积不染色；2．离心：1000转/分，5分钟，弃上清；3．重悬：加入200μl Binding Buffer，混匀；4．染色：加入5μl Annexin

V-FITC，室温避光孵育10分钟；5．离心：1000转/分，5分钟，弃上清；6．重悬：加入200μl Binding

Buffer，混匀；7．染色：加入5μl PI，直接上机。细胞凋亡双染的时候要注意什么？包括漂浮在培养基上的细胞，一起收集；洗细胞后，建议轻轻摇匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失；一次检测很多样本，加入PI应该有一定的时间间隔（一般以30~60s为宜），因为PI本身有毒。对照组凋亡比例高的原因细胞状态不好；细胞收集后存放的时间太长，没有及时染色；细胞表面原有的PS相对较多，应选用低浓度的AnnexinV标记；

PBMC

表面往往有血小板黏附在细胞表面，造成Annexin V阳性率偏高；过分吹打、震荡或胰酶消化等，可能使PS暴露出来。处理组凋亡比例低的原因凋亡刺激得不够；细胞本身生长状态可能对刺激因素不敏感，如过度增殖的细胞对凋亡的诱导不太敏感；

Annexin V

的结合缓冲液失效，应4 ℃保存；贴壁细胞消化时间过长，膜表面的PS受损，Annexin V结合位点减少。