搞懂illumina nextera Tn5 和ATAC seq adaptor 序列

在准备NGS文库的时候，会有用到转座酶Tn5，Nextera DNA Library Preparation Kit ，比如ATAC-seq就有用到这个Tn5。转座酶携带有特定的序列称为转座子Transposon。

下面是ATAC-seq的工作原理，想必听说过ATAC-seq的，对这个图都会再熟悉不过了。

Tn5是kit里面带有的，没什么大不同。ATAC-seq 的barcoded primers （adaptors）会有一些不同，接下来，看下图中的每段序列对应的sequnce都是什么。

Jason Buenrostro 2015.png

下面图例，Nextera tn5用来给基因组DNA加adaptors。

Screen Shot 2017-10-26 at 18.42.09.png

放大tn5:
在tn5二聚体里面的双链的Oligo是Nextera Tn5 binding site，19个碱基，全部都是一样的。伸出来的部分是单链的序列，蓝色：Nextera tn5 read1 (5'-TCGTCGGCAGCGTC-3')；红色：Nextera tn5 read2(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3')

Tn5 sequence.png

Nextera Tn5 binding site (19-bp Mosaic End (ME)): 5'- AGATGTGTATAAGAGACAG -3’
Nextera N/S5xx primer entry point (s5)／Tn5 Read 1: 5'- TCGTCGGCAGCGTC -3'
Nextera N7xx primer entry point (s7)／ Tn5 Read 2: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG -3'
Illumina P5 primer 1: 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'
Illumina P7 primer 2: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3’
Tn5 Read 1 （包括ME）sequence: 5'- TCGTCGGCAGCGTC（AGATGTG，TATAAGAGACAG） -3’ （33bp）
Tn5 Read 2 （包括ME）sequence: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG（AGATGT，GTATAAGAGACAG ）-3’ （34bp）

下面的图片就是准备ATAC-seq时候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一点类似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，没有index （barcode），所以只有一个。Reversed引物有24个Ad2.（1-24），所以有24组不同的index （barcode）序列。这个index序列是和Nextera一样的。我涂红色部分就是index序列的反向反义序列，每个index序列是不同的8个碱基，这个和Nextera的i7（部分一样，请自己对照）是一样的。

i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里没有barcode

N/S502 : CTCTCTAT
N/S503 : TATCCTCT
N/S505 : GTAAGGAG
N/S506 : ACTGCATA
N/S507 : AAGGAGTA
N/S508 : CTAAGCCT
N/S510 : CGTCTAAT
N/S511 : TCTCTCCG
N/S513 : TCGACTAG
N/S515 : TTCTAGCT
N/S516 : CCTAGAGT
N/S517 : GCGTAAGA
N/S518 : CTATTAAG
N/S520 : AAGGCTAT
N/S521 : GAGCCTTA
N/S522 : TTATGCGA

i7 sequence:

    N701 : TCGCCTTA
    N702 : CTAGTACG
    N703 : TTCTGCCT
    N704 : GCTCAGGA
    N705 : AGGAGTCC
    N706 : CATGCCTA
    N707 : GTAGAGAG
    N710 : CAGCCTCG
    N711 : TGCCTCTT
    N712 : TCCTCTAC
    N714 : TCATGAGC
    N715 : CCTGAGAT
    N716 : TAGCGAGT
    N718 : GTAGCTCC
    N719 : TACTACGC
    N720 : AGGCTCCG
    N721 : GCAGCGTA
    N722 : CTGCGCAT
    N723 : GAGCGCTA
    N724 : CGCTCAGT
    N726 : GTCTTAGG
    N727 : ACTGATCG
    N728 : TAGCTGCA
    N729 : GACGTCGA

图片发自App

1. 所以，ATAC-seq的这个Oligo designs （Adaptors）可以大概总结：

有两种Adaptors，分别为Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。

其中Adaptor1（5’ illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3’），Adaptor2（5’ illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3’）

这样算来，ATAC-seq library的长度=左面（Adaptor1 长度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA长度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 长度）=open chromatin 的DNA长度 + 128bp。

所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library长度大概是(单核小体146bp+核小体free region)+两端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二个peak。图中显示大概是340bp左右。所以free region应该是330bp-274bp=56bp 。

那么会问，对不对呢？看下bioanalyzer的第一个peak，显示是182bp，这个peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列长度 + 两端的adaptor及Tn5部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不难得出同样的结果，nucleosome free region序列长度是54bp。差不多哦

以此类推，第三个peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之间，是不是等于两个核小体长度加上核小体空隙序列再加上两个adaptor， 2146bp + 255bp + 128bp= 530bp （为什么55bp也要乘2？答：多出来一个核小体当然就多出来一份核小体空隙）

综上所述，ATAC-seq library长度比genome DNA实际长度一定多出128bp。

ATAC-seq bioanalyzer.png

nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome

2. 下面一个问题，tagmentation时候，会出现gap？Nextera tagmentation on amplified cDNA (will create 9-bp gap）？

“GAP不是服装品牌，而是个坑”。

Screen Shot 2017-10-26 at 18.42.09.png

所以需要在PCR第一步，需要5min的72摄氏度来填坑。
还要注意，就是在tagmentation的时候会出现三种产物，上面的图只是其中一种。

Screen Shot 2017-10-26 at 20.18.42.png

哪里说的不对欢迎纠正，请留言。

参考：
http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Transposon_Tn5
http://nextgen.mgh.harvard.edu/attachments/Nextera%20Protocol.pdf
https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/SMART-seq_family.html
http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/ez-tn5-transposase.pdf?sfvrsn=4