2. 蛋白质组学样品前处理(1)

说明:此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成,侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院(IBS)的刘晓慧博士所授。


主要知识点
样品前处理需要达到的目的
不同类型样品提取方法及进展介绍
不同预分级策略介绍


样本前处理

2. 蛋白质组学样品前处理(1)_第1张图片
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上面的图描述了整个蛋白质组学的分析流程:咱们先从组织、体液或细胞中提取蛋白质,拿到蛋白混合溶液(根据你的研究目的,可以对蛋白先做分离,或者不分离),接下来还原烷基化(还原的过程是将蛋白的二硫键打开,然后烷基化可以修饰巯基,防止游离的巯基再生成二硫键)处理,并酶解成肽段。红线以上都属于样品的制备阶段。

既然蛋白质谱实验的目的,是为了尽可能准确地对尽可能多的蛋白进行检测,那么,顺理成章的,我们做这些复杂的前处理的目的,就是要减少在实验阶段对蛋白的人为降解和修饰,释放尽可能多的肽段,送进质谱来检测。

为了更好地聊这个问题,我们先来复习一下如何利用质谱检测蛋白质,以此来反推前期样品处理需要达到怎样的目的。

2. 蛋白质组学样品前处理(1)_第2张图片
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拿到处理好的蛋白样品以后,我们先将样品酶解成肽段,得到一级谱图,再由肽段离子与惰性气体碰撞生成碎片离子,得到二级谱图。然后我们用实验谱图与理论谱图进行匹配,从而判断肽段的氨基酸组成,然后再根据肽段反推出蛋白质。

上图的最下面是是数据库里搜索的序列,绿色部分是置信度在95%以上的肽段,红色是置信度在50%以上的肽段。基于这些置信度比较高的肽段,我们才能推断出这个蛋白存在于样品中。所以,对于每个蛋白质来说,根据实验谱图匹配到的肽段越多,对于这个蛋白的鉴定结果就越可信。

那么,样品预处理时,首要目的就是避免随机降解,才能得到用特定蛋白酶特异性剪切得到的肽段,拿这些肽段生成的实验谱图与理论谱图比对,才能得到可靠的比对结果。否则,蛋白的随机断裂位点与特异性酶切位点根本对不上,那拿到的实验谱图与理论谱图完全就是两回事,最后的结果就是,要么检测不到蛋白,要么检测到的都是错的。

样本的收集与保存

样本预处理之前,我们需要先收集和保存样品。这一步可不能马虎,如果收集的方法或者保存的方式不得当,就会严重影响后面的预处理步骤以及实验结果!以下三类样品的收集与保存尤其需要留意:

组织样品

1) 对于人体手术切除的组织,有条件的话,最好用PBS(磷酸缓冲盐溶液,作为溶剂,起溶解保护试剂的作用)取完之后直接去血。如果没有去血,可以-80℃液氮保存,干冰运输。

2)对于小鼠、大鼠、兔子之类的组织样品,建议用灌流的方式来去血,尤其是像肝脏、胃、心脏这类大的组织,可以直接用灌流的方式去血,去得最干净。其次的方案是在后期剪碎的时候去血。

话说,这里为什么要强调去血呢?因为血液中有十几种含量特别高的高丰度蛋白质,占了血液蛋白总量的95%,如果你的研究目标并不包括血液蛋白,而这部分蛋白又存在于样品中,那就悲剧了。大家回忆一下,我们第一节课的听课笔记中专门提到的数据依赖性采集(DDA),当样品中有大量高丰度蛋白的时候,来自中低丰度蛋白的肽段信号就会被大大抑制,连进入二级质谱的机会都会变得很渺茫,还怎么愉快地检测?

细胞样品

常规实验,建议收到5*1E6-1E7个细胞以上的样品量(有些实验需要的样品量会少一些,后面会详细讲)。细胞取好后,首先用PBS清洗一下细胞表面,因为大部分培养基里面都含有血清,这部分血清得洗干净了先~

如果是做分泌蛋白研究的话,首先用PBS清洗样品几次,再用条件培养基(不含有血清的培养基)进行培养,根据细胞情况,大概12个小时以后,离心,去掉细胞碎片,取上清,就能提取到分泌蛋白了。

血清样品

1)血浆样品:可以通过医院常用的EDTA抗凝管进行收集,收集到的血浆会呈悬浮状态,离心去掉血细胞。

2)血清样品:现在大部分研究都直接针对血清样品,它的成份更简单,没有凝集素,没有大量的血细胞,针对性会更强。收集血清样品时,直接把血清吸到管子里,室温静置让它凝结,上清黄色部分就是血清样品啦。

好,我们收集好样品后,接下来就开始做样品前处理了。它分几步走呢?看下图:

2. 蛋白质组学样品前处理(1)_第3张图片
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对于以上这些步骤,后面会详细聊,这里我们先做点儿背景铺垫,大伙儿心里先有个谱:

铺垫

铺垫之一:第二步“充分溶解蛋白”尤为重要,如果蛋白没有充分溶解,能提取到的蛋白就会很少,达不到研究目的。

铺垫之二:在第一、二步,即破碎样品和溶解样品的过程中,为了减少人为操作引入的修饰,通常会准备大量的冰,进行冰上的操作。同时还需要加入蛋白酶抑制剂,防止在操作过程中蛋白被样品中自带的蛋白酶降解掉。

说到样品中自带的蛋白酶,尤其要高度重视的是胰腺样品,如果你在室温下解冻,整个样品可以直接化成水。胰腺本身含有非常丰富的胰蛋白酶,在体外的室温环境下,胰蛋白酶的活性没有谁来抑制它,于是可以完全释放天性,把组织样品里的蛋白都分解掉了!所以针对胰腺样品,要非常小心,必须在冰上操作,利用低温环境控制蛋白酶的活性。

铺垫之三:关于第三步“解旋蛋白质”。通常,蛋白质都是成球状的稳定状态,解旋蛋白质就是将球状蛋白中的二硫键打开,让它形成链状结构,以便进行下一步酶切。以下图胰岛素结构图为例,胰岛素分子通过很多二硫键形成稳定的球状结构,亲水基团主要集中在表面,而疏水基因都包裹在里面,如果用特异性酶直接作用于这些球状蛋白,包裹在里面的序列就不容易被酶作用到,酶切的效率就会很低~

如果能将这些二硫键打开,球状结构被破坏,蛋白分子就会变成链状,酶切位点才能尽可能多地暴露在酶环境里,这时候我们再加入特异性酶,就能得到更多的酶解肽段。

2. 蛋白质组学样品前处理(1)_第4张图片
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铺垫之四:对于第五步去除杂质,其实伴随着整个预处理的过程。杂质都是从哪里来的呢?比如,从组织中带来的杂质,提取溶液、酶解样品中带来的盐等。我们要知道,质谱是一个非常灵敏的仪器,它检测的是多肽的质荷比。所有的盐类,以及所有会进行离子化的杂质,都会干扰到肽段的检测。所以我们会要求进入质谱之前的蛋白样品非常干净。在蛋白水平及肽段水平都会进行去除杂质的步骤。

样品的破碎

好,接下来我们就从破碎样本开始,详细聊聊每一步具体应该怎么做,需要用到哪些方法、工具和试剂,以及操作的技巧和需要注意的那些小细节。

第一步 破碎样品

2. 蛋白质组学样品前处理(1)_第5张图片
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样品破碎的方法主要分三类:

机械破碎

1)液氮研磨:适用于大部分组织样品,比如常见的胃脏样品、肠样品、肝脏样品等。把所有的器皿、研钵,以及样品,都放到-80℃环境下,然后把样品放到研钵里,倒入液氨,整个样品会冻得非常脆,然后就大力研磨,直到磨成粉末。

2)匀浆:适用于亚细胞器的破碎,使用Dunce匀浆器。注意哈,匀浆没有液氨研磨那么剧烈,除亚细胞器以外的蛋白提取,通常还是建议用液氨研磨,破碎得更充分一些。

3)捣碎法:用研磨的方法破碎样品,如果样品量又大,那可是件非常辛苦的事情!于是一些公司推出了细胞破碎仪,利用玻璃珠或者磁珠剧烈地震荡,或者用刀片高速旋转,总之,用电力代表人力,帮助我们做样品破碎。

物理破碎

1)温差法:通常用于含有细胞壁的样品,比如一些细菌样品,利用高温和低温的反复变化,破坏细胞壁。

2)压力差法:适用于组织样品,通过高压和低压的反复变化,实现对组织样品的破碎。

3)超声破碎法:适用于细胞层次的样品。

化学处理

使用各种水解酶、变性剂或表面活性剂等,破碎细胞的膜结构,导致细胞的破碎。

事实操作中呢,我们通常会将几种方法结合起来使用。比如先液氨研磨,拿去提取蛋白,检测一下蛋白含量,发现破碎不够充分,于是又再用超声的方法,或者结合比较强的变性剂的方法等等,增强样品破碎的程度,释放更多的蛋白。

说到化学处理法,我们来看看样品前处理中会用到哪些抽提试剂吧。

2. 蛋白质组学样品前处理(1)_第6张图片
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上面列出的一些重要的试剂,我们来详扒一下:

8M尿素:这是比较强的变性剂,有时也会用6M尿素。

需要注意的是,在加入8M尿素以后,所有处理过程不能超过37℃,否则会将蛋白质的氨基胍基化,影响蛋白质的理化性质,影响后续的酶解,以及质谱检测,后果很严重!另外,如果这一步你用了8M尿素,后面又要用胰酶来做酶解,那么加入胰酶之前,一定要先将尿素稀释到1M,否则高浓度的尿素会让胰酶也变性,失去活性。

硫脲:能起到助溶的效果,也是一种还原剂,它的还原性与一些试剂盒是不兼容的,比如BCA试剂盒。

Tips: 处理过程中,我们要注意每一步的溶剂是否与下一步的溶剂兼容(兼容的意思就是,能不能一起使用)。根据它们的兼容性来进行选择。

4%SDS:很强的去污剂,但与胰酶不兼容,并且很难通过超滤的方法脱去的,它在超滤脱盐的过程中仍保留在蛋白样品中间。对于这类去污剂,我们通常会利用有机溶剂来去除它们,比如丙酮沉淀。

Tips: 这些去污剂,在样品进入质谱前都要去除干净,否则它们会在质谱的电场下离子化,影响我们的分析。因此呢,去污剂要慎用!

还原剂:功能是打开二硫键,使蛋白分子尽量从球状变成链状,增加蛋白质的溶解性,以及暴露出尽可能多的酶切位点。

蛋白酶抑制剂:夏天尤其需要,当温度比较高的时候,酶的活性也会较高,蛋白样品很容易发生自降解。如果做特殊样品的处理,比如磷酸化样品或其它翻译后修饰样品的富集,要针对性地加入这一类酶的抑制剂。

有机试剂:用来沉淀蛋白质,去除杂质。比如前面提到的去污剂,我们就可以利用有机试剂来去除它们;另外,针对植物样品或昆虫样品,样品本身含有很多色素,比如叶绿素,昆虫翅膀上的色素等,也可以用有机试剂将色素溶解掉,然后进行洗涤。

特别注意:整个处理过程中,所有使用的EP管、枪头、装试剂的塑料瓶,都尽量用进口的产品,尤其是当使用到强溶解性的溶液!国产的EP管上的材料(聚乙二醇)很容易被这些溶液洗脱下来,进入样品中,并且很难洗脱掉。而聚乙二醇非常容易离子化,会在质谱里形成很强的塑料峰,甚至会完全掩盖目标肽段的峰,造成检测的失败!

下次继续聊针对不同样品的蛋白提取方法、提取完的质量控制等部分内容。

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