活体动物体内生物发光和荧光成像技术
基础原理与应用简介
活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。活体动物体内成像技术主要分为可见光成像 (opticalimaging)、核素成像（radio-nuclearimaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超声（ultrasound）成像、计算机断层摄影（computed tomography ，CT）成像五大类，其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，通常称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，通常称为结构成像。功能成像与结构成像比较，前者更能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。所以，活体动物体内功能成像技术可用于观察和追踪靶细胞、基因的表达，同时检测多种分子事件，优化药物和基因治疗方案，从分子和细胞水平对药物疗效进行观察，从整体动物水平上评估疾病发展过程，对同一个动物进行时间、环境、发展和治疗影响跟踪。由于功能成像的诸多优势，这项技术广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面，本文重点介绍活体动物可见光成像技术。
体内可见光成像(optical in vivoimaging)技术主要包括生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)成像两种技术。生物发光成像是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的探针光信号；而荧光成像则是采用荧光报告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等荧光染料进行标记，利用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源。前者是动物体内的自发光，不需要激发光源，可通过高度灵敏的CCD直接捕捉光信号，而后者则需要外界激发光源的激发才可以捕捉发光信号。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，体内可见光成像技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据也更加真实可信。另外, 这一技术由于不涉及放射性物质，具有操作简单，所得结果直观，灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。
（一）技术原理
1. 标记原理
哺乳动物生物发光，一般是将Fireflyluciferase基因（由554个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
除Firefly Luciferase外，有时也会用到RenillaLuciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用Firefly
Luciferase作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
2.底物荧光素的特点
荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：
(1) 荧光素不会影响动物的正常生理功能。
(2)荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
(3) 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30 min后开始衰减，约3h后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35min之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。
(4) 观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。
3. 光学原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。
（二）活体生物发光成像技术应用领域
活体生物发光成像技术是一项在某些领域有不可替代优势的技术，比如肿瘤转移研究、药物开发、基因治疗、干细胞示踪等方面。
1．肿瘤学
活体生物发光成像技术能够让研究人员直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研究得到发展。建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理。
2．药物研究
在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细胞。而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更灵敏的发现药物的疗效。
利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。
在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。
在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律（图11-2）。在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路。
生物发光成像技术优点
与荧光成像技术相比较，生物发光成像技术主要的优势有：
1．特异性强，无自发荧光
以荧光素酶作为体内报告源的生物发光方法，是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强。动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景，极高的信噪比。但用荧光方法时，在受到激发光激发时，生物体中皮肤、毛发和各种组织及食物等都会产生荧光，特别是被标记的靶点深臧于组织内部，需要较高能量的激发光时，也就会产生很强的背景噪音。虽然荧光信号强度远远超过生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。
2．高灵敏度
生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。荧光成像的灵敏度最高也只能在动物体内检测到约105细胞，相对于生物发光在动物体内监测到102数量级细胞的灵敏度要相差很多。
3.检测的深度
由于生物发光的灵敏度高于荧光成像，对于需要深部成像的研究（检测的深度在3~4cm），如干细胞、原位肿瘤与转移，自发肿瘤等，应用生物发光成像是最佳的选择。
4.精确定量
生物发光信号可以用于精确定量，因为荧光素酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，单位细胞的发光数量很稳定。即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。而对于荧光，激发光需要穿过组织到达靶点，发射光需要从体内出来，路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度较难定量。荧光成像定量需要仪器的激发光能够保证持续长时间稳定，并均匀照射到动物体表。