[知识回顾]类器官—疾病研究和药物开发新工具

类器官（Organoid）是一种通过3D培养等方式获得的细胞培养物，具有相应器官的一些关键特性，细胞来源可以为体细胞、成体干细胞（包括祖细胞）或多能干细胞。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型[1, 2]。与2D模型相比，类器官更接近器官组成和行为、基因组更稳定、更适合于生物转染和高通量测序筛选的研究模型。而且与常用的动物模型相比，类器官模型操作更为简便、快捷，观察更直观。自2009年上皮类器官成功建立以来[3]，目前已有结肠、肝脏、胰腺、前列腺、胃、输卵管、卵巢、味蕾、唾液腺、食管、肺、子宫内膜、乳腺、血管等各种类器官模型。

类器官的应用

类器官可用于疾病模型的建立，与传统的2D模型相比，类器官在阐明疾病的发展、稳态和发病机制方面更具优势，为相关研究提供了新的方法和思路。例如，奥地利科学院分子生物技术研究所在体外成功诱导人类多能干细胞分化血管类器官，其相关成果于今年2月发表在Nature杂志[4]。这是人类首次在实验室中培育出近乎“完美”的人造血管，对研究糖尿病发生的血管病变过程具有重大意义。

类器官亦可用于药物筛选，多种原发性肿瘤如膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等均已培养出其对应的类器官，这些类器官已经成为临床药物筛选的重要模型。此外，类器官在药物不良反应、精准医疗、基因编辑及细胞疗法等方面也具有十分广阔的前景。

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血管类器官

近年类器官领域研究进展案例

卵巢癌的类器官生物样本库建立

2019年荷兰的Hans Clevers（类器官研究鼻祖）研究组和Wigard P. Kloosterman研究组在Nature Medicine发表科研成果。该研究在体外建立了可长期扩增的卵巢癌类器官模型，而且涵盖了大部分的卵巢癌亚型[5]。

目前捕获卵巢癌(Ovarian cancer, OC)细胞标志物和异质性的体外模型较少且很难建立。该团队使用卵巢癌病人样本组织诱导成类器官，并且可长期培养的OC体外模型。他们已经从32名患者中建立了56个OC类器官系，涵盖了大部分的卵巢癌亚型。通过细胞形态学以及免疫组化染色，确认了该类器官与病人组织切片的特征高度一致。

此项研究还证明了OC类器官在药物筛选中的应用价值，并获得了不同的肿瘤亚型对铂类化疗的反应，包括获得复发性疾病中的化学抗性。OC类器官具有可被异种移植的特性，具有体内药物敏感性测定应用潜力。为未来药物筛选以及不同卵巢癌亚型对于化疗的响应提供了重要的工具平台。

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OC类器官的亚型多样性和组织学特征

乳腺癌类器官生物样本库建立

Hans Clevers团队还利用类器官技术建立了一个乳腺癌类器官生物样本库，用于捕获乳腺癌的异质性[6]。

研究人员收集了150多例乳腺癌患者组织样品，利用一种可以长期培养和维持类器官的方法，成功建立了100例以上乳腺癌类器官，成功率高达80%以上。并分别对乳腺癌类器官进行了组织病理学、全基因组测序、转录组测序以及药敏活性检测。综合结果表明，乳腺癌类器官较好的保持了原位肿瘤的组织学和遗传学特征。不仅如此，在经过多次传代培养后，这些特征仍稳定保留在类器官中。最终该研究团队建立了一个乳腺癌类器官生物样本库，并承诺这一“类器官样本库”可以供科研人员免费使用，以助力科学研究和新药开发。

膀胱癌类器官生物样本库建立

膀胱癌是美国第五大流行的癌症，美国哥伦比亚大学的一项研究建立了患者衍生的类器官生物库，并概括了人类膀胱癌的组织病理学和分子多样性[7]。类器官系通常可以保留亲本肿瘤异质性，并表现出与相应肿瘤进化一致的基因组变化谱。研究表明，患者来源的膀胱肿瘤类器官在研究肿瘤演变和治疗反应应用中都是非常可靠的模型系统。

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研究策略

该研究对包含两种轻重类型癌症，不同人种，不同性别的人类样本构建了16种类器官系统。该系统可以重演人类膀胱癌的突变谱，还可以重现对类器官的药物筛选临床问题，以及使用突变谱预测药物反应。

膀胱癌患者通常在疾病进展的早期被诊断出患有非肌肉浸润性癌症，然而切除治疗对患者的影响往往是灾难性的。因此，通过在类器官样品培养中筛选鉴定的阳性药物，在源自类器官的异种移植物中得到验证，并用于指导膀胱癌治疗，是值得膀胱癌患者期待的重要应用。

“癌症之王”的类器官模型

胰腺癌是一种恶性程度高且诊疗困难的恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来明显上升，5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。

2014年12月31日，冷泉港实验室在《Cell》上发表研究，文中研究人员成功培养出小鼠和人的胰腺癌类器官，进而通过正常细胞和癌细胞比较，研究胰腺癌的发病机理[8]。

在研究人类胰腺类癌器官时，由于85%的胰腺癌患者不适合手术，研究人员采取内窥镜活体抽取癌细胞（如图）。该方法广泛适用于胰腺癌患者，并且可以连续采样。胰腺类器官作为易处理和可移植的系统，可用于在小鼠和人类肿瘤进展的分子和细胞特性研究，有望加速胰腺癌治疗个性化方法的发展。

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样本获取及培养

结肠类器官来用于结直肠癌建模与药物检测

2017年6月，美国威尔康奈尔医学院（WeillCornell Medicine College）的研究人员在Nature Medicine上发表论文。该研究利用家族性腺瘤性息肉病（FAP）患者皮肤成纤维细胞诱导的多能干细胞构建了结肠类器官[9]。研究证实，该结肠类器官具有结肠组织的生物学特征，包含干细胞、短期扩增细胞、分化细胞等。

研究人员利用该类器官进行了XAV939、雷帕霉素、遗传霉素三种药物的体外测试，用来验证其在结直肠癌靶向药物开发应用的潜力。XAV939和雷帕霉素明显抑制FAP细胞增殖，同时也会抑制普通细胞的生长，表明这些药物可能会伤害健康的结肠组织。遗传霉素则成功地恢复了FAP9组织中的正常生长，但对FAP8或健康对照组织没有影响。研究结果表明，可以使用结肠类器官模拟结肠癌，用于确定靶向药物的选择。

肿瘤免疫微环境的类器官模型助力临床治疗

2018 年底，来自美国斯坦福大学的Calvin J. Kuo研究组，在Cell杂志上以长文形式发表研究成果，通过气液交互法（air-liquid interface，ALI）培养患者肿瘤上皮及其肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL），得到肿瘤患者来源的类器官（Patient-derived organoids,PDOs），重现患者肿瘤免疫微环境[10]。

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ALI-PDOs 模型图示

研究者通过ALI-PDO技术体外培养了来自100个患者，14个组织位点，28种疾病亚型的肿瘤组织。验证了这些组织均能保留原肿瘤组织中固有的纤维基质和免疫组分。研究人员还对PDOs和原位肿瘤的单细胞同时进行了5’V(D)J和RNA-seq测序。通过该技术验证了PDOs中同样能够还原肿瘤组织中的T，B和NK细胞，并进一步验证了PDOs中的肿瘤浸润免疫细胞能够还原原位肿瘤中的TCR全部位点。该研究还分别通过小鼠和人源肿瘤组织，验证了ALI-PDOs可以还原肿瘤组织中PD-1依赖的免疫检查点。

在肿瘤免疫治疗如火如荼的今天，迫切的需要能够个体化验证疗效的体外模型。但是鉴于肿瘤微环境的复杂性，免疫治疗药物体外实验一直无法与临床疗效相匹配。PDO技术则为这一需求提供了技术出口。

肠道类器官的建立及移植应用

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肠道类器官

17年，来自日本九州大学的Shizuka Miura研究团队在Cell Stem Cell上发表了的研究成果，该团队通过对小鼠成纤维细胞重编程使其成为肠祖细胞和肠干细胞[11]。在体外培养成为肠类器官之后，将其移植到受伤的小鼠肠道中，一段时间饲养之后研究人员惊奇的发现移植的类器官已经成为小鼠肠道的一部分。更令人兴奋的是，研究人员对人的血管内皮细胞进行重编程之后也产生了类似的结果。该研究成果为类器官的应用提供了一个新思路。

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肠道类器官

展望

尽管在类器官研究领域已经取得了非常显著的进展，该领域目前仍面临着诸多挑战。一方面，类器官仍不具备人体内的微环境，它缺少人体组织中必要的成分，如脉管系统和免疫系统等；另一方面，肿瘤类器官培养技术复杂，不同组织甚至不同亚型需要不同的培养条件，更合理的培养方法仍需进一步研究。 未来更需要结合临床实践, 发展新一代的类器官培养体系。总体来说, 类器官在基因水平和生理形态上能够良好地模拟供体内相应的组织, 也适用于高通量的药物筛选, 同时为疾病的个性化治疗提供了研究模型。随着新的开发和探索，类器官在未来有望得到更为广泛的应用。

参考文献

1. Sato, T. and H. Clevers, Growing self-organizing mini-guts from asingle intestinal stem cell: mechanism and applications. Science, 2013. 340(6137): p. 1190-1194.

2. Lancaster, M.A. andJ.A. Knoblich, Organogenesis in a dish:modeling development and disease using organoid technologies. Science,2014. 345(6194): p. 1247125.

3. Sato, T., et al., Single Lgr5 stem cells build crypt–villusstructures in vitro without a mesenchymal niche.Nature, 2009. 459(7244): p. 262.

4. Wimmer, R.A., etal., Human blood vessel organoids as amodel of diabetic vasculopathy. Nature, 2019.

5. Kopper, O., et al.,An organoid platform for ovarian cancercaptures intra-and interpatient heterogeneity.Nature medicine, 2019: p. 1.

6. Sachs, N., et al., A living biobank of breast cancer organoidscaptures disease heterogeneity. Cell, 2018. 172(1-2): p. 373-386. e10.

7. Lee, S.H., et al., Tumor evolution and drug response inpatient-derived organoid models of bladder cancer.Cell, 2018. 173(2): p. 515-528. e17.

8. Boj, S.F., et al., *Organoid models of human and mouse ductalpancreatic *

9. Crespo, M., et al.,Colonic organoids derived from human inducedpluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.Nature medicine, 2017. 23(7): p.878.

10. Neal, J.T., et al., Organoid modeling of the tumor immunemicroenvironment. Cell, 2018. 175(7):p. 1972-1988. e16.

11. Miura, S. and A.Suzuki, Generation of mouse and humanorganoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming.Cell stem cell, 2017. 21(4): p.456-471. e5.

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