在上一篇文章PH525x series - Bayesian Statistics中是将层次模型应用到了棒球运动当中，这篇文章作者讲的是在高通量数据的分析中如何应用层次模型。
既然是层次模型，那我们首先要做的就是构建两个，第一个描述的是样本或单元之间的变异，第二个则描述的是某种特征之间的变异。这次作者使用的例子是limma包中的一组基因表达数据（2组，每组3个样本，其中共有16个差异显著基因），这个包提供了一种修饰，比原本的更具有统计效力。
与棒球运动的例子不同的是，这次我们为方差建模。我们先来看使用原本的检验做差异显著检验的结果是怎样的：
library(SpikeInSubset) ##Available from Bioconductor data(rma95)
library(genefilter)
fac <- factor(rep(1:2,each=3))
tt <- rowttests(exprs(rma95),fac)
smallp <- with(tt, p.value < .01)
#注意pData(rma95)获得的那些基因是真实存在差异的基因，共16个
spike <- rownames(rma95) %in% colnames(pData(rma95))
cols <- ifelse(spike,"dodgerblue",ifelse(smallp,"red","black"))
with(tt, plot(-dm, -log10(p.value), cex=.8, pch=16,
xlim=c(-1,1), ylim=c(0,4.5),
xlab="difference in means",
col=cols))
abline(h=2,v=c(-.2,.2), lty=2)
上述结果有两点问题，这第一便是使用FDR对值进行检验之后，仅剩1个基差异显著的基因；
sum(p.adjust(tt$p.value,method="BH")[spike] < 0.05)
## [1] 1
当然导致这一结果的原因肯定与样本量过少有关。第二个问题就是按照的值对基因进行排序后，无论是取排名前多少的一组基因，这当中都包含了很多的假阳性，比如在排名前10的基因中有6个是假阳性：
table(top10 =rank(tt$p.value <=10, spike)) #t-stat and p-val rank is the same
## spike
## top10 FALSE TRUE
## FALSE 12604 12
## TRUE 6 4
从上面的火山图中我们可以看到，小p值但又是假阳性的那些基因其实就是那些效应力很小（也就是标准误会很小）的基因（图中那些红点其横坐标集中在了）。我们可以通过下图确认这点：
tt$s <- apply(exprs(rma95), 1, function(row) sqrt(.5 * (var(row[1:3]) + var(row[4:6]) ) ) )
with(tt, plot(s, -log10(p.value), cex=.8, pch=16,
log="x",xlab="estimate of standard deviation",col=cols))
这种情况下，使用层次模型会更有效。如果我们能够为这些基因的方差构建分布模型，就可以根据这种分布修饰那些过小的p值，从而达到提高统计效力的目的。
根据PH525x series - Statistical Models（二）中介绍的分布可知，我们可以使用如下模型为方差建模：
像我们这种利用经验（empirical）数据构建先验分布（Bayesian approach）的方法就是经验贝叶斯方法。现在我们有了每个基因的观察值，也有了先验分布模型（即F分布），按照如下公式公式就可以去计算方差的后验分布平均值了：
在这里，是观察值的方差（observed variance，就是实际的方差），是全局方差（global variance，其实就是后验分布的方差，也就是由果求因得到的真实的方差）。在得到后验分布的均值和标准差之后，我们就可以使用这两个数值去进行moderated t-tests了，这一过程说起来复杂，代码其实就几行：
library(limma)
##先为每个基因构建一个线性模型
fit <- lmFit(rma95, model.matrix(~ fac))
##进行经验贝叶斯检验
ebfit <- eBayes(fit)
##提取差值与p值
limmares <- data.frame(dm=coef(fit)[,"fac2"], p.value=ebfit$p.value[,"fac2"])
##绘图
with(limmares, plot(dm, -log10(p.value),cex=.8, pch=16,
col=cols,xlab="difference in means",
xlim=c(-1,1), ylim=c(0,5)))
abline(h=2,v=c(-.2,.2), lty=2)
这样一来，在p值升序排列的前10个基因中假阳性率就降到了2：
table( top10=rank(limmares$p.value)<= 10, spike)
## spike
## top50 FALSE TRUE
## FALSE 12608 8
## TRUE 2 8
可见这种moderated t-tests的统计效力要比原始的** t-tests**要好。还有一个重要的点要知道：原先那些标准差接近0的样本在通过层次模型矫正后就不再接近0了，而是朝着的方向收缩。
函数讲解：
limFit(object): Fit linear model for each gene given a series of arraysebayes(fit)： Given a microarray linear model fit, compute moderated t-statistics, moderated F-statistic, and log-odds of differential expression by empirical Bayes moderation of the standard errors towards a common value.coef(object)： ‘coef’ is a generic function which extracts model coefficients from objects returned by modeling functions.
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