Western Blotting

Western Blotting

Western Blotting，即免疫印迹，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，它结合了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的高 分辨率与抗原抗体反应的特异性。

其基本原理是：通过电泳将蛋白组分分开，然后将电泳后凝胶上的蛋白质转 移至载体膜上，用封闭试剂封闭载体膜上未吸附蛋白质的区域，最后通过免疫学 检测来分析特定的蛋白质表达水平。

免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其分辨率和灵敏度，广泛地应用于检测特定基因表达产物的正 确性，或者比较表达产物的相对变化量。

实验前准备

实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材，主要包括：各种凝胶配 置液、各种缓冲液、相关抗体、PVDF 膜，赛默飞公司的 QSP 盒装吸头及 Nunc 冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器等。

主要仪器有：Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、离心机、电泳
仪等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程为：

• 首先制备蛋白样品
• 然后进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，
• 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至 PVDF 膜上，
• 接着对含有蛋白质的 PVDF 膜进行免疫学检测，X-胶片显影定影后，扫描图片，最 后用 IPWIN6.0 软件分析结果。

蛋白样品的制备

按 1ml 裂解液加 10 μl 的 100mmol PMSF，混匀后置于冰上待用。注意：PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，PMSF 是剧毒物质，操作时要谨慎。

蛋白样品一般来源于基因工程菌或特定的真核细胞，本实验以单层贴壁细胞 总蛋白的提取为例。

• 倒掉离心管中的上清，用移液枪吸去残余培养液，注意不要吸走细胞。
• 每管细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂 解，要经常上下颠倒离心管。
• 然后于 4℃ 10000×g 离心力离心 5min。 将离心后的上清分装转移至干净的离心管中，分装至少两份，放于-80℃保存。
• 蛋白质定量：按 BCA 蛋白质定量试剂盒操作说明进行操作，用 Thermo
  Scientific 全波长扫描式多功能读数仪于波长 562nm 处检测OD值，绘制标准曲 线并计算样品蛋白浓度，取适量上清，加入上样缓冲液，煮沸 10min。缓慢恢复 至室温后，稍离心，放于-20°C 保存。

SDS-PAGE 电泳

凝胶的制备

灌胶前，需组装好制胶器，将洗净且干燥的两块玻璃板底端对齐后安放在灌胶支架上。

参照 12%分离胶配制体系依次加入各个组分，混匀。将配置好的凝胶，沿玻 璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡。根据梳子深度确定灌制高度，通常距 离矮板至少 2cm，灌好后，注入水封胶。

此时可按照配方配制 5%浓缩胶，注意TEMED在灌胶前再加入。

注意：AP最好在配好一周内使用，TEMED避光保存，分离胶和浓缩胶的Tris pH值分别是 8.8 和 6.8。
静置一段时间待凝胶聚合，凝胶聚合后，弃去封胶溶液，并用吸水纸吸干。

往浓缩胶里加入适量TEMED，混匀后缓慢灌入到胶槽至矮板顶部，插上梳 子，操作时避免产生气泡。

静置一段时间至凝胶聚合，拔下梳子，用蒸馏水冲洗胶孔。 此时制好的胶可进行后续实验。

上样及电泳

安装电泳槽，注意确保内槽不漏缓冲液，往电泳槽加入足量电泳缓冲液， 缓冲液要没过玻璃板和凝胶。

吸取适量样品或者分子量标准 Marker，缓慢加入至胶孔。注意：加样太快会 使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时，要注意更 换枪头，以免交叉污染。

上样完毕后，盖上电泳槽盖子，接通电源，设置电泳条件，一般浓缩胶 15mA，
分离胶 20mA，或恒压 100 -120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可关闭电泳仪停止电
泳。

转膜

将玻璃板从电泳槽中取出，用塑料切胶器在玻璃板的两边轻轻撬动，至到小玻璃板开始松动。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，注意不要把分离胶刮破。将剥出的胶浸于纯水中 5min，重复三次后放在转膜液中浸泡 10min。

PVDF 膜预先用甲醇浸泡 5min，然后将转印膜、印迹滤纸和海绵垫浸泡于转移缓冲液中 10min。膜和印迹滤纸的大小应裁剪至与胶的大小相当。在黑色面板上放置一层海绵垫，并依次放置至少 3 层印迹滤纸，凝胶，转印膜和至少 3层印迹滤纸。放置膜时尽量一次性准确放置，凝胶与转印膜一旦接触就不要再移动，并记住膜与胶的接触面。玻璃试管轻轻滚压滤纸挤出气泡，并用海绵覆盖。关上转印夹，合上锁扣。安装好的转印夹应该使胶紧密地与 PVDF 膜接触而不被挤压。

将组装好的夹子装入转移电泳槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面。添加电泳缓冲液，盖好盖子，开启电泳仪，设置电泳条件，一般用 200mA 1-2h，或用恒
压 100V 1-2h。

注意：电泳转移时会产热，需要在电泳槽的一边放一些冰来降温。

转膜完成后，就进入免疫反应。

免疫反应

印迹后的 PVDF 膜用 5%脱脂奶粉溶液室温孵育封闭１h，也可在 4℃过夜。将抗Caspase 3 的鼠源单克隆抗体用一抗稀释液稀释至适当浓度，室温下孵育 PVDF 膜 1-2h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗 3 次，每次 10min，再用TBS 洗一次，10min。将过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗或 X GAPDH 抗体按照适当比例用 TBS 稀释，室温下孵育 PVDF 膜 30min 至 1h用 TBST 于室温下脱色摇床上洗 3 次，每次 10min；再用 TBS 洗一次，10min。

ECL化学发光与 X光片定影

加入显色底物后按常规X光片显影方法将转印膜上的信号转移至X光片上。

半定量结果分析

将定影后的X光片扫描保存为电脑文件，并用 IPWIN 6.0 分析软件对图片 上每个特异条带灰度值进行数字化分析。

具体操作如下：

• 打开 Image Pro Plus 软件，点击 File，打开结果图片。
• 首先进行光密度校对，点击 Measure，Calibration，点击 Intensity。在 Intensity Calibration 窗口中，点击 New，选中 Std.Optical Density，点击 Optical，点击 Imax ge，选择图中最亮的一点。然后点击 Ok，依次在新出现的对话框中点击 Ok， System，然后关闭小对话框。
• 点击Measure，Count/Size，点击 Select Color，Color Cube Based，使用滴管 将要分析的条带覆盖成红色，即AOI，关闭窗口。点击Measure，Select Measure， 选择Area 和 IOD。在 Count/Size 窗口中，点击 Options。Label Style 选择 Measurement，可选择将 Area 或是 IOD的值显示在各AOI 上。点击Ok，点击 Count，即得到各AOI 的 IOD值。点击View，Measurement Data，可见每个AOI 对应的面积和累积光密度值。在Statistics 窗口可查看面积和光密度的总值。
• 接下来进行数据处理：样品中目的蛋白的IOD值除以内参X GAPDH 的IOD 值，所得结果代表某样品目的蛋白的相对含量。
• 利用此软件，可以对一系列的梯度条带进行数字化分析和处理，如内参为XGAPDH的CXCR four 的分析，内参为 β-Actin 的Caspase 3 的分析等。

疑问与解答

Doctor A，转膜完毕，经染色后发现蛋白条带不是很清晰，请问是什么原因？
这个问题问的很好，转膜是 Western Blotting 实验中很关键的一步，一般转
膜不充分，我们从以下几个方面来分析：首先，PVDF 膜可能没有完全均匀湿透， 需要用 100%甲醇浸泡约 15min，从而活化 PVDF 膜上的带电基团，提高其结合 蛋白的能力；其次，小于 10KD 的靶蛋白容易穿透膜转移至缓冲液中，应选择小 孔径的膜，缩短转移时间；另外，转移缓冲液中甲醇浓度过高会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，降低其甲醇浓度或者使用乙醇、异丙醇等代替； 最后要注意转移缓冲液中 SDS 的浓度，是否加 SDS 与目标蛋白溶解性有很大关 系。一般来说，疏水性很强的蛋白，比如分布于细胞膜上的蛋白，或者一些 100KD以上的蛋白也可能出现溶解性不足，由于其容易在凝胶里形成聚集沉淀，因此在 转移缓冲液中加入终浓度为 0.1%的 SDS，以避免出现这种情况。但是对于小蛋 白，SDS 妨碍蛋白与膜的结合，这种情况下，转移缓冲液中可以不加 SDS。

实验的时候发现，转膜后可以看到 Marker 条带，可是在免疫反应后却没有 阳性条带，请问是什么原因？
答案已经很明显了，问题是出在免疫反应的步骤中，考虑以下两点：首先， 抗体结合不充分，调整一抗和二抗的稀释比例，延长孵育时间；然后可能是显色 体系的问题，直接将酶标二抗和底物进行混合，如果不显色，则需要更换新的酶 标二抗或相应显色底物。

实验最后得到的结果，发现背景很高，请问怎样改善实验操作，才能降低背景颜色？
背景高也是很多初学者经常遇到的问题，具体的的原因及解决方法有如下几 条：首先同样是 PVDF 膜没有完全均匀湿透，使用 100% 甲醇浸透膜；其次可 能是封闭不充分，选择合适的封闭试剂，如：脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等，增加 封闭液孵育时间，或者提高温度；第三，免疫反应时洗膜不充分: 增加洗液体积 和洗涤次数；最后还要考虑是不是曝光过度，缩短曝光时间。

谢谢 Doctor A的解答，还有最后一个问题。Western Blotting 为什么必须使 用内参,常用的内参有哪些,具体怎么使用内参？
在 Western Blotting 中使用内参其实就是在此过程中应用内参对应的抗体检 测内参的表达量，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样 品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用 内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个 Western Blotting 发 光体系是否正常等。常用的蛋白质内参有X GAPDH和细胞骨架蛋白 β-Actin 或 β-tubulin。具体使用内参的方法通常有以下两种：当目的蛋白的分子量大小与选 用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后，根据预染的蛋白 质 Marker 大小将膜剪为目的蛋白和内参蛋白两部分，然后两块膜分别与目的蛋 白抗体和内参蛋白抗体进行孵育以及显色。另外一种是，当目的蛋白的分子量大 小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体孵育显色和检测，然后使用 Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗 体温育、显色检测。