WB实验问题总结（Western blot蛋白质印迹）

1.为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

答：原因有很多：

a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；

b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

2.我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；

b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

3.我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB？

答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。

4.我的目的带很弱，怎么加强？

答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

5.胶片背景很脏，有什么解决方法？

答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 

6.目标带是空白，周围有背景，是为什么？

答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

7.我的胶片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；

c) ECL底物没覆盖到相应位置；

d) 二抗失活。

8.我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片

是什么原因呢?

答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善；

b) 显影时间过长。

9.DAB好还是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

10.抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体；

b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等。

11.蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了。为什么？

答：可能是：

a)样品浓度过低；

b)转移时间不够。

12.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？

答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

13.要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

答：① 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

② 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

14.电泳中常出现的一些现象

︶ 条带呈笑脸状

原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

︵ 条带呈皱眉状

原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾

原因：样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）

原因：样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜

原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散

原因：加样量过多。

15.Western blot结果中背景较高可能的原因及建议

膜封闭不够

延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

16. Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议

目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

上样量过高，太敏感

适当减少上样量。

一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

一抗不纯

纯化抗体

一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

17.Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议

检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

检测样本低表达目的蛋白

提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

转移不完全或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

18.其它现象

膜上多处出现黑点或黑斑

原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

反白（条带显白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

蛋白分子量偏低或偏高

原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

19.安全问题

操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。