单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述（应用篇二）

编者按：本文是Illumina团队出的NGS技术在单细胞研究中的应用，坊间以pdf的形式传阅，余以为多有不便，今摘抄于此。版权归原作者所有，侵删，内容仅供学习，更多详细信息请阅读原文。由于是综述文章，引用较多，这里为放方便阅读见，从略。

本篇紧承单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述（应用篇一），主要介绍单细胞技术在药物发现、生殖健康、微生物生态学和进化、植物生物学、法医学、等位基因 – 特定基因表达方面的应用。

药物发现

现代药物发现涉及与疾病进程高度相关的新药物靶标的确定，随后为高度特异的、基 于靶标的治疗干预研发。在给定的组织中，细胞可表达最多400个药物靶基因，表明药物靶标的相对丰度。但是，组织由多种遗传多样性细胞类型组成，且大量测序法 中的衍生生物噪声可掩盖感兴趣的特定基因。单细胞测序法在发现和鉴定药物靶标以 及提高制药筛选方面具有巨大前景。

过去五年单细胞组学工具发展迅速，其在广泛的治疗方法和治疗策略发现和研发中的应用中具有巨大的潜力。”——Heath 等，2016 年

肿瘤细胞的单细胞测序增强了我们对肿瘤中肿瘤异质性、药物反应和耐药机制的理 解。 同样，循环肿瘤细胞的单细胞分析着重于遗传异质性、治疗敏感性和转移 潜力。

近期临床资料已表明免疫系统功能的治疗性增强可使癌症患者受益。阻断 CTLA-4 和PD-1的抗体在大量癌症中诱发临床反应，包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤。单细胞测序法使我们有可能更深入地了解免疫细胞和肿瘤细胞之 间复杂的相互作用，更彻底地鉴定肿瘤的细胞学生态体系。

除揭示肿瘤—宿主免疫相互作用的机制以外，单细胞法还揭示了对感染性病原微生物 的宿主免疫应答。 我们对微生物多样性的理解和鉴定持续扩展，且单细胞测序可 帮助鉴定环境中感染性病原体的丰度。最后，对无法培养的微生物进行基因组鉴定 可帮助发现可在制药研发中用作新化学结构的新天然产物。

单细胞测序法正在重塑我们对过敏原特异性B细胞在食物过敏, 以及B细胞介 导的中和抗体对感染物的反应中所发挥的作用的理解。 单细胞测序法还阐明了调 控人类自体免疫性疾病中的T细胞分化和生物学过程的新机制，包括类风湿性关节 炎、 SLE、 多发性硬化症、I 型糖尿病和自身免疫性脑脊髓炎。

参考文献

• Keren-Shaul H, Spinrad A, Weiner A, et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 2017;169:1276-1290 e1217

阿茨海默病是慢性神经退行性疾病，无法治愈。其发病率随年龄增加，约6%的65岁及以上人群受此疾病影 响。148 为了更好地理解阿茨海默病的细胞病因，作者对来自健康转基因小鼠和患阿茨海默病的小鼠的约8000个 单个免疫细胞进行了单细胞RNA-Seq。数据发现了一个与神经退行性疾病相关的新发小胶质细胞。这些小胶 质细胞含有Aβ 颗粒，该颗粒是阿茨海默病的分子标志。数据表明，这一新免疫细胞类型具有限制神经退行 的潜力，对治疗阿茨海默病具有潜在意义。

Illumina的技术：NextSeq 500系统

• Shaffer SM, Dunagin MC, Torborg SR, et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 2017;546:431-435

许多肿瘤可通过化疗治愈，但它们最终会对癌症药物产生耐受性。因此，理解耐药性机制成为研究的热门领 域。约60%的黑色素瘤的BRAF激酶基因中携带V600E突变，这使肿瘤细胞对BRAF抑制剂维莫非尼敏感； 但是，一部分肿瘤细胞最终会产生耐药性。在本研究中，作者从黑色素瘤患者样本中分离了单个肿瘤细胞， 然后在存在维莫非尼的条件下进行培养。对亲本细胞以及维莫非尼抗性亚克隆中119个癌症相关基因的靶向 DNA测序表明，在抗性亚克隆中没有出现新突变。然后，他们对亲本细胞及维莫非尼抗性细胞进行了基于群 落的RNA-Seq，结果确定抗性细胞中多个已知的抗性标记基因表达增加。此外，暴露于药物中的抗性细胞中 许多抗性标记基因表达增加。总之，这些数据提出了单个肿瘤细胞耐药性的新机制。

Illumina的技术：HiSeq 2500系统

• Nguyen A, Yoshida M, Goodarzi H and Tavazoie SF. Highly variable cancer subpopulations that exhibit enhanced transcriptome variability and metastatic fitness. Nat Commun. 2016;7:11246

肿瘤细胞遗传异质性在耐药性中发挥作用；但是在本研究中，作者专注于了解癌症表型异质性可能如何对癌 症进展产生影响。研究分离了显示出高形态学变异的等基因克隆癌细胞。这些高度变异的亚群对大量抗癌药 物的反应显示出升高的存活和转移潜力。作者对这些克隆执行scRNA-Seq，并发现表达的形态学变异增强了 转录组变异性，尽管在遗传上稳定。最后，研究将剪接体–机械基因表达中的高度变异与转录组变异和转移 的促进联系起来。这些数据阐明了克隆内肿瘤异质性新的一面，并进一步表明升高了的耐药性、存活和转移 的机制。

Illumina的技术：Nextera Extended Exome Sequencing Kit、HiSeq 2500系统

• Wei W, Shin YS, Xue M, Matsutani T, Masui K, et al. Single-Cell Phosphoproteomics Resolves Adaptive Signaling Dynamics and Informs Targeted Combination Therapy in Glioblastoma. Cancer Cell. 2016;29:563-573

成胶质细胞瘤是致死性最高的癌症之一。成胶质细胞瘤在多个可用作药物治疗的通路中存在突变，由于其快 速且广泛的耐药性，业已证明当前的靶向治疗无效。具体来讲，mTOR通路的机械靶标是90%成胶质细胞瘤 的关键驱动力，但是肿瘤细胞发展了对mTOR靶向治疗的快速耐药性。在本研究中，作者使用NextSeq 500 系统获得单细胞基因组数据，并将这些数据与使用mTOR抑制剂治疗的肿瘤细胞中的单细胞蛋白组数据联系 起来。这些数据显示成胶质细胞瘤肿瘤细胞中对mTOR抑制剂的耐药性在药物治疗开始几天内发生。令人惊 讶的是，与单细胞测序数据的关联表明此耐药性通过非遗传机制（上调特定信号磷蛋白）进行。该研究启发 了一种在治疗成胶质细胞瘤中设计药物复合治疗的新方法。

Illumina的技术：NextSeq 500系统

• Gaublomme JT, Yosef N, Lee Y, Gertner RS, Yang LV, et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 2015;163:1400-1412

在适应性免疫系统中，促炎性IL-17生成的Th17细胞有助于病原体的清除，但也与自身免疫性和炎症性疾病存在关联。虽然Th17细胞显示出广泛的细胞异质性，该异质性的遗传基础还未清楚确定。在本研究中， 作者使用 HiSeq 2000/2500 系统对从患有 EAE 的患者分离出的单个 Th17 细胞执行 scRNA-Seq。研究将该数 据集与来自体外分化的正常Th17细胞的scRNA-Seq数据进行了比较。研究数据显示了来自自身免疫患者的 Th17细胞中的遗传异质性。此外，研究使用转基因小鼠验证了参与EAE发展的4个基因（Gpr65、Plzp、 Toso 和Cd5l）。这些结果可帮助发现自身免疫性疾病中的新药物靶标。

Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2000/2500系统

• Kim KT, Lee HW, Lee HO, et al. Single-cell mRNA sequencing identifies subclonal heterogeneity in anti-cancer drug responses of lung adenocarcinoma cells. Genome Biol. 2015;16:127

肿瘤内异质性与癌症的不良临床预后相关，但尚未完全理解该相关性的机制。在本研究中，作者分离了 34 个 PDX肺腺癌肿瘤细胞，并使用HiSeq 2000/2500系统执行了scRNA-Seq。通过簇生成69个肺腺癌预后基因（包 括KRAS），该研究可将PDX细胞分类为4个不同的亚组。从抗癌药物治疗存活下来的PDX细胞的scRNA- Seq表明带有活化KRAS 变异的肿瘤细胞为抗癌药的靶标，尽管KRAS 本身并不是靶标。该研究的scRNA- Seq 数据还表明对耐药性有作用的肿瘤细胞可被大量肿瘤的基因组掩蔽。

Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Prep Kit、HiSeq 2000/2500系统

• Luna JM, Scheel TK, Danino T, et al. Hepatitis C virus RNA functionally sequesters miR-122. Cell. 2015;160:1099-1110

丙型肝炎病毒（HCV）为黄病毒科的RNA病毒，是全球肝脏疾病的主要元凶。HCV需要肝脏特异性肿瘤抑制 因子microRNA（miR）-122进行复制，但是HCV感染进行的内源性miRNA的调控尚不确定。在本研究中， 作者生成了HCV感染期间的整个miRNA:靶标相互作用图谱，并阐明了HCV病毒RNA隔离miR-122以抑制 正常宿主靶标。研究随后通过从包含miR-122位点的报告基因分析表达数据，对RNA隔离在单细胞水平进行 了验证和定量，确认了HCV感染期间显著抑制。结果描述了HCV诱导的miR-122隔离的模型，并指示了该 机制可增强 HCV 的长期致癌潜力。

Illumina的技术：MiSeq 和 HiSeq 2000系统

• Suzuki A, Matsushima K, Makinoshima H, et al. Single-cell analysis of lung adenocarcinoma cell lines reveals diverse expression patterns of individual cells invoked by a molecular target drug treatment. Genome Biol. 2015;16:66

单个肿瘤细胞的单细胞测序具有将遗传异质性与药物反应和耐药性联系起来的潜力。在该研究中，作者在 336个来自细胞系的肺腺癌细胞单细胞基因表达中鉴定了异质性。该研究还在使用多酪氨酸激酶抑制剂（凡 德他尼）治疗之前和之后分析了肺腺癌细胞。研究发现细胞看家基因的相对表达多样性在暴露于凡德他尼的 癌细胞中降低。相比之下，凡德他尼靶标基因（包括EGFR 和RET）的表达多样性仍不变。研究数据表明基 因表达分散度的模式在肿瘤细胞获得耐药性方面发挥重要作用；此外，该基因多样性并没有由大量肿瘤的 RNA-Seq揭示。

Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2500系统

• Tipton CM, Fucile CF, Darce J, Chida A, Ichikawa T, et al. Diversity, cellular origin and autoreactivity of antibody-secreting cell population expansions in acute systemic lupus erythematosus. Nat Immunol. 2015;16:755-765

急性SLE为复发性自体免疫性疾病，攻击多种组织且无法治愈。自身免疫活动与B细胞骤增相关。美国FDA 批准的唯一SLE疗法——贝利单抗，靶标B细胞激活因子。在本研究中，作者从正在遭受SLE爆发的患者分 离了B细胞，并使用深度测序和蛋白组学法分析B细胞的多样性。研究表明来自SEL爆发患者的B细胞为多 克隆。通过测序单个B细胞，研究还鉴定了新激活的在SLE爆发期间提供自身抗体重要来源的B细胞亚群， 表明 SLE 自体反应发生于多克隆激活期间。这些结果可指导患者治疗选择，并方便未来 SLE 治疗的计划

Illumina的技术：MiSeq 系统。

生殖健康

产前诊断指出生前胎儿和胚胎疾病或遗传情况的检测。先天缺陷可通过检测受损染色体或DNA异常加以诊断。传统上，该诊断使用侵入性操作（如羊膜穿刺术）。非侵入性产前检测（NIPT）与传统检测方法相比更具可信度，仅需抽血。 150通过游离 DNA （cfDNA）测序的 NIPT 已用于临床并改善了产前诊断。

单细胞测序能够基因组、外显子组、转录组或表观基因组进行全局测序，进而对早期胚胎进行全面 分析。——Zhu 等，2017年

单细胞测序在PGS/PGD领域也很有用，可在植入前筛查胚胎是否有染色体异常。 研究显示了测序如何帮助对用于研究或植入的体外产生配子（IVG）进行基因测试。 单细胞测序诊断可加速研究、改善胚胎状态的早期检测，并确保能够移植健康的体外受精（IVF）胚胎。

参考文献

• Krjutskov K, Katayama S, Saare M, et al. Single-cell transcriptome analysis of endometrial tissue. Hum Reprod. 2016;31:844-853

先前已对许多活检组织进行了单细胞转录组分析，但尚未发表子宫内膜的单细胞转录组分析。在本研究中，作者呈现了子宫内膜单细胞基因表达谱的完整流程，从采样到数据分析。研究从子宫内膜分离出单个基质细胞和上皮细胞，并使用FACS分离相应细胞类型，然后进行scRNA-Seq。同时，研究培养了子宫内膜基质细胞，并与未培养的细胞比较了完整表达谱。作者发现，与活检细胞相比，有2661个基因（包含于8622个所检测的基因）在培养的基质细胞更具活性。此外，241 个基因在活检和培养的各个细胞中表达差异显著。

Illumina的技术：HiSeq 系统

• Petropoulos S, Edsgard D, Reinius B, et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 2016;165:1012-1026

在人发育过程中，合子进行细胞分裂，形成成熟囊胚的3个细胞类型：滋养外胚层（TE） 、原始内胚层（PE）和外胚层（EPI） 。在本研究中，作者使用HiSeq 2000系统对从88个人植入前胚胎中分离出的1529个单个细胞进行了转录组测序。研究建立了人胚胎植入前发育的完整转录图谱，阐明了TE、PE和EPI的谱系都同时发生，并与胚泡形成重合。研究数据还确定了可能对胚胎植入前发育有重要作用的新基因，如ARGFX、FOXA2 和 LINC00261。最后，转录图确定了人类X 染色体剂量补偿的独特特征。

Illumina的技术：HiSeq 2000系统

• Kumar A, Ryan A, Kitzman JO, et al. Whole genome prediction for preimplantation genetic diagnosis. Genome Med. 2015;7:35PGD可进行人类胚胎的遗传分析，以在植入前筛查遗传性疾病。虽然单细胞测量的近期技术进步强调该方法在PGD中应用的前景，但DNA扩增偏倚和相对较长的周转时间限制了该方法的应用。在本研究中，作者将单体型亲本基因组测序与快速胚胎基因分型结合起来，以预测一个五天人胚胎的全基因组序列。作者预测了300万个父本/母本杂合子位点的遗传（精度＞99%），以及亲本HBA1/HBA2缺失的传播。数据表明PGD可加速胚胎中遗传疾病的诊断。

Illumina的技术：HiSeq 2000系统、CytoSNP-12

• ChipYan L, Huang L, Xu L, et al. Live births after simultaneous avoidance of monogenic diseases and chromosome abnormality by next-generation sequencing with linkage analyses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:15964-15969

NGS方法提高了PGS/PGD的精密度。虽然精确度受假阳性和假阴性SNV所限，连锁分析可克服该困难。在本研究中，作者研发了MARSALA，一种将使用HiSeq平台的新一代测序与单细胞全WGA结合的方法。此方法可进行单分子精确度的胚胎诊断，并极大的降低了假阳性和假阴性错误。此为第一个基于集成式新一代测序的 PGD 程序，同时检测疾病导致的突变和染色体异常，并执行连锁分析。

Illumina的技术：HiSeq 2500系统

• Zamani Esteki M, Dimitriadou E, Mateiu L, et al. Concurrent whole-genome haplotyping and copy-number profiling of single cells. Am J Hum Genet. 2015;96:894-912

在分析单细胞DNA-Seq数据前，必须将DNA拷贝数异常与WGA杂峰区分开。该要求使得单细胞测序数据DNA拷贝数分析和单倍型分析有难度。在本研究中，作者研发了一种单细胞基因组分析法，可在单细胞全基因组确定单倍型和拷贝数——称为haplarithmisis的程序。方法解读单细胞的SNP等位基因片段，并将这些数据整合到计算工作流程中进行关联疾病变异的归因（siCHILD） 。作者通过对来自人体外受精胚胎的单个淋巴细胞和人分裂球确定单细胞基因组中带有疾病等位基因的单倍型验证了该方法。

Illumina的技术：TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit、HumanCytoSNP-12v2.1 BeadChips、HiSeq 2000/2500系统

微生物生态学和进化

我们不仅持续发现新的物种和微生物， 当前的NGS技术可帮助我们了解微生物生态学和进化的动力学。这些发现包括产生选择压力导致物种进化的宿主—物种相互作用 。这类见解对了解复合生态体系和许多组成生态体系的独特微生物至关重要。测序还可加速对这些新物种及其在相应环境中的进化作用的检测。

“来自宏基因组学和单细胞基因组的新基因组信息可使我们了解微生物代谢协同和依赖性，创造新的培养方法。”——Solden等，2016 年

参考文献

• Dyksma S, Bischof K, Fuchs BM, Hoffmann K, Meier D, et al. Ubiquitous Gammaproteobacteria dominate dark carbon fixation in coastal sediments. ISME J. 2016;8:1939-1953

海洋沉积物是地球上最大的碳汇，其中一半的化学合成海洋碳固定发生在近海岸沉积物。但是，进行该活动的微生物却未知。通过测量横跨欧洲和澳大利亚13个近海岸沉积物的细菌16S rRNA的基因多样性，作者鉴定出了属于硫氧化细菌的γ-变形菌纲组。14C-碳同化研究显示这些未培养出的γ-变形菌纲占近海岸沉积物中碳固定的80%。最后，作者从环境样本分离出来单个细胞，并执行了单细胞WGS以鉴定将氢氧化活动与硫氧化γ- 变形菌纲联系起来的基因。

Illumina的技术：MiSeq 和 HiSeq 2000系统

• Spencer SJ, Tamminen MV, Preheim SP, Guo MT, Briggs AW, et al. Massively parallel sequencing of single cells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. ISME J. 2016;10:427-436

在微生物生态学研究中，16S rRNA测序可鉴定微生物群落成员，而鸟枪法元基因组学可确定群落的功能性多样性。但是，将这两种方法组合起来在技术上具有挑战性。在本研究中，作者研发了乳液法、配对分离和链状结合PCR（epicPCR，一项将功能基因与种系发育标记联系起来的技术）。该研究将此技术应用于来自马塞诸塞Upper Mystic Lake的淡水中数百万的未培养单个细胞。具体来说，该研究分析了淡水湖群落内的硫酸盐还原群落，并可鉴定新的假定硫酸盐还原硫酸盐还原菌。该方法适用于鉴定功能群体成员，追踪基因导入并绘制微生物细胞内的生态学相互作用图。

Illumina的技术：MiSeq 系统

• Tsementzi D, Wu J, Deutsch S, et al. SAR11 bacteria linked to ocean anoxia and nitrogen loss. Nature. 2016;536:179-183SAR11细菌是地球海洋中最丰富的微生物，构成所有富氧表层海洋中微生物细胞的一半。虽然认为需要氧，SAR11在氧水平低的海洋环境中也丰富。在本研究中，作者使用MiSeq系统对来自从海洋含氧量最低区域分离出的SAR11亚群的19个单细胞扩增基因组进行测序。研究发现已适应低氧环境的SAR11细菌编码大量呼吸硝酸还原酶。这些酶执行脱氮作用的第一步，是由微生物促进的可最终产生分子氮（N2）的硝酸盐还原过程。这些数据重新定义了地球上最丰富生物组的生态位，并表明 SAR11细菌对含氧量最低区域的脱氮有作用。

Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、MiSeq和 HiSeq系统

• Combe M, Garijo R, Geller R, Cuevas JM and Sanjuan R. Single-Cell Analysis of RNA Virus Infection Identifies Multiple Genetically Diverse Viral Genomes within Single Infectious Units. Cell Host Microbe. 2015;18:424-432

遗传多样性是病毒进行免疫逃逸和疫苗逃逸、产生耐药性和导致疾病的关键决定因素。假设单个病毒粒组成病毒感染单位。但是，作者对自90个单独感染细胞的881个VSV斑来执行了单细胞测序，并显示单个病毒感染单位由多个遗传多样性病毒基因组组成。研究还发现多个基因组病毒变异可同时传递给相同的单个细胞，且自发病毒突变率在各个单独细胞之间变化，对病毒产量有影响。本研究在单细胞水平开展，对我们对病毒多样性和进化的理解有意义。

Illumina的技术：MiSeq 系统

• Labonte JM, Swan BK, Poulos B, et al. Single-cell genomics-based analysis of virus-host interactions in marine surface bacterioplankton. ISME J. 2015;9:2386-2399

病毒感染可改变海洋群体的组成和代谢潜能，以及宿主群体的进化。所有海洋微生物都可能受病毒感染影响；但是，我们对宿主–病毒之间的相互作用的了解有限。在本研究中，作者对 58 个分离的海洋微生物使用单细胞 WGS，以确定单个细菌和古菌细胞内的以及其附属的病毒基因组蓝图。数据包括奇古菌门、海洋微生物、疣微菌门和 γ-变形菌纲的最早已知病毒。研究阐明了单细胞基因组发可洞察复杂环境中宿主–病毒之间的相互作用。

Illumina的技术：NextSeq 500系统

• Lima-Mendez G, Faust K, Henry N, Decelle J, Colin S, et al. Ocean plankton. Determinants of community structure in the global plankton interactome. Science. 2015;348:1262073

海洋浮游生物是世界范围内最大的生态体系，且由病毒、原核生物、真核微生物、浮游植物和浮游动物构成。该生态系统结构和组成受环境条件和养分供给的影响。在本研究中，作者分析了313个来自Tara Oceans expedition的浮游生物样本，并从Illumina测序的元基因组和18S rDNA V9序列获得了病毒、真核生物和原核生物丰度谱。研究使用网络推理和机器学习法构建浮游生物群组之间的相互作用组。特别是作者通过将假定的宿主重叠群与从单细胞基因组获得的病毒数据比较，确认了预测的病毒 – 宿主之间的相互作用。

Illumina的技术：Illumina测序的元基因组（mi 标签）和 18S rRNA V9序列

• Martijn J, Schulz F, Zaremba-Niedzwiedzka K, et al. Single-cell genomics of a rare environmental alphaproteobacterium provides unique insights into Rickettsiaceae evolution. ISME J. 2015;9: 2373-2385

立克次氏体科包括导致流行性斑疹伤寒的病原体普氏立克次氏体，因而立克次氏体科的宿主—病毒相互作用具有重要意义。在本研究中，作者发现了 Candidatus Arcanobacter lacustris，即一种从 Damariscotta 湖中分离出的立克次氏体科姐妹谱系 α-变形菌纲。研究使用 HiSeq 2000 系统对 Candidatus Arcanobacter lacustris进行了单细胞 WGS。其基因组的种系发育和比较分析揭示了趋化性和鞭毛基因的存在。这些基因在立克次氏体科中唯一，并表明立克次氏体科的祖先可能具有兼性生活方式。

Illumina的技术：HiSeq 2000系统

植物生物学

虽然转录组提高了我们对植物发育的理解，但单细胞转录组尚未在植物中广泛应 用。单细胞测序法可进一步大大提高我们对植物生物学的理解。 但是，植物细胞封闭在坚硬的细胞壁基质内，分离单个植物细胞在技术上仍有困难。在拟南芥中，大量技术已用于分离单个细胞，包括原生质体化以去除植物细胞壁随后进行FACS，以及细胞壁消化随后进行玻片微小取量。在玉米仁中，LCM代谢区的RNA-Seq已揭示了植物内胚乳细胞分化的细节，而单个玉米小的孢子WGS提高了我们对植物减数分裂重组的理解。虽然仍存在技术困难，scRNA-Seq法将彻底改变我们有关植物生物学的知识。

“单细胞植物系统生物学的持续应用可能会改变我“单细胞植物系统生物学的持续应用可能会改变我们对植物中不同细胞类型的关系、发育和进化的观点 。”——Libault

参考文献

• Giacomello S, Salmen F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017;3:17061

与哺乳动物系统类似，植物功能生物学由在不同组织中差异调控的具有空间朝向的基因表达程序驱动。利用单个植物细胞的单细胞RNA-Seq解析基因表达的空间组织是可行的，并已通过利用植物组织的激光捕获显微解剖（LCM，见下文）和FACS得以实现。在本研究中，作者展示了产生植物空间转录组数据的新方法。他们将拟南芥（Arabidopsis thaliana）组织冷冻切片在条形码标记的芯片上进行了成像，该芯片含有位点特异性条码，与寡聚（dT）寡核苷酸偶联。合成cDNA后，他们使用NextSeq系统鉴定了每个芯片位点内的基因表达。通过整合空间信息和基因表达数据，作者鉴定了拟南芥 8 个组织区域的基因表达差异。

Illumina的技术：NextSeq 系统

• Adrian J, Chang J, Ballenger CE, Bargmann BO, Alassimone J, et al. Transcriptome dynamics of the stomatal lineage: birth, amplification, and termination of a self-renewing population. Dev Cell. 2015;33:107-118

植物气孔便于植物与大气进行气体交换。在拟南芥中，气孔的产生和方式来自可解析成中间步骤的分散谱系。尽管RNase L 具有生物学显著性，但此酶切割的RNA尚未清楚地确定。在本研究中，作者使用Illumina测序揭示宿主和病毒RNA中RNase L 分裂位点的频率和位置。方法使用经RNase L 和RNase A 分裂的病毒RNA，以及来自感染和未感染HeLa细胞系的RNA进行优化并验证。作者确定了受RNase L 和其他单链特定核糖核酸内切酶作用的散在基因组区域。监测宿主和病毒RNA中RNase内分裂位点的频率和位置揭示了这些酶如何对健康和疾病产生影响。

Illumina的技术：TruSeq SBS Kit v3–HS、HiSeq 2000系统

• Li X, Li L and Yan J. Dissecting meiotic recombination based on tetrad analysis by single-microspore sequencing in maize. Nat Commun. 2015;6:6648

减数分裂重组通过等位基因组合，形成自然选择的底物，并改进真核生物基因组，在遗传多样性上发挥着重要作用。玉米已成功用作重组变异分解的遗传模型，但由于难以测序单个植物细胞和配子，在核苷酸水平分辨率下了解单个减数分裂事件在以前是不可能的。在本研究中，作者研发了一种方法，用于分离和 WGS 单个玉米四分体的四个小孢子。研究使用 HiSeq 2000 系统测序 96 个单独小孢子，确定了 600,000 个高质量 SNPs，进而可以非常高的分辨率鉴定重组模式。其高分辨率重组图谱揭示交换更易在基因而非基因间区域发生；此外，交换在注释基因的5'-和 3'-端区域尤其常见。

Illumina的技术：TruSeq DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2000系统

• Zhan J, Thakare D, Ma C, Lloyd A, Nixon NM, et al. RNA sequencing of laser-capture microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. Plant Cell. 2015;27:513-531

谷类内胚乳是全球范围内食品、饲料和原料的主要来源，但是内胚乳细胞分化的基因控制尚不清楚。在本研究中，作者将激光捕获显微解剖（LCM）和Illumina测序结合起来，以分析玉米（玉蜀黍）仁的分化中内胚乳的五种主要细胞类型和四个代谢区的mRNA。研究确定了在各个代谢区专门累积的mRNA以及在一个或多个代谢区优势表达的基因。研究结果表明MRP-1转录因子可激活基底内胚乳转移层内的基因调控网络。这些数据提供玉米仁代谢区的高分辨率基因活动图集。研究还揭示了与主要内胚乳细胞类型分化相关的调控分子。

Illumina的技术：TruSeq DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2000系统

法医学

NGS已彻底改变了现代法医学的许多领域，包括短串联重复序列（STR）分析、单卵双生辨别、Y染色体分析、线粒体全基因组研究、年龄估测、死亡原因确定、体液鉴定、取证微生物分析、物种鉴定和世系推理。 单细胞取证分析首次报告于1997年，当时van Oorschot等对226个显微操作分离的单个颊黏膜细胞执行了STR分析。 单细胞测序法适用于由于生物材料极少量而受阻的犯罪调查。在性侵犯罪中，精子细胞可降解或可被受害者的上皮细胞污染，但是单个精子细胞的mtDNA分型可解决该问题。单细胞 mtDNA 分析也已应用于其他人组织和血液的单个细胞。

参考文献

• Jayaprakash AD, Benson EK, Gone S, et al. Stable heteroplasmy at the single-cell level is facilitated by intercellular exchange of mtDNA. Nucleic Acids Res. 2015;43:2177-2187

除细胞核基因组以外，真核细胞还携带有线粒体基因组，而mtDNA分析是法医检定法的有效工具。 184异质性（细胞中存在多个mtDNA单倍型）可在有重要意义的案例中增加DNA证据的强度。但是，由于mtDNA占细胞总DNA的1%以下，鉴定mtDNA多样性富有挑战性。在本研究中，作者研发了Mseek，一种纯化并测序mtDNA的方法。研究使用MiSeq系统对来自人PBMC的mtDNA测序，以表明异质性在经过多次细胞分裂后在单个子细胞中保持稳定。

Illumina的技术：MiSeq 系统

• Hanson E, Haas C, Jucker R and Ballantyne J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in ‘touch DNA’ evidence. Forensic Sci Int Genet. 2012;6:548-558

法医学案例工作经常关注犯罪现场留下的微量或痕量生物材料。来自这些样本的法医学图谱通过“触碰DNA”证据阐述，可理解为通过物理接触从皮肤细胞转移到物体的DNA。在本研究中，作者使用Genome AnalyzerIIx 从大量人组织以及来自少量细胞的极少量RNA（5–25pg）中获得转录组数据。通过比较各个样本的表达数据，研究确定了 5 种可在几乎所有触碰 DNA 样本中检测到的个人皮肤高度特性 mRNA 标记。

Illumina的技术：GAIIx 系统

等位基因 – 特定基因

表达二倍体生物有两组染色体，从每个亲本各获得一组。基因可从一个等位基因（单等位基因表达）或从两个等位基因（双等位基因表达）转录。虽然群体测序提供基因表达的整体描述，但罕见异构体的表达水平可能会丢失。单细胞测序法可检测这些罕见异构体，以及单等位基因和双等位基因之间的变化。

与已建立的方法相比（如RNA荧光原位杂交（FISH） 、RNA测序、PCR和活细胞成像），单细胞RNA测序可提供对群体内单个细胞中单等位基因或双等位基因的最准确描述。 将RNA表达数据与SNP数据结合起来可确定导致优势等位基因表达或沉默的特定 SNP。此外，该方法可阐明这些基因在癌症或组织特异性分化中的作用。

参考文献

• Borel C, Ferreira PG, Santoni F, et al. Biased allelic expression in human primary fibroblast single cells. Am J Hum Genet. 2015;96:70-80

哺乳动物细胞中含有两个可发生基因转录的等位基因，mRNA是从一个还是两个等位基因活跃转录而来是大量研究的主题。在本研究中，作者使用HiSeq 2000系统对203个单独的人原代成纤维细胞执行RNA-Seq，以确定等位基因特异性表达水平。研究数据显示，对于一个细胞中的大多数基因，转录仅来自一个或两个等位基因。此外，在给定的细胞中基因表达两个等位基因非常罕见，其等位基因特异性表达与细胞转录水平相关。

Illumina的技术：Nextera XT DNA Kit、TruSeq RNA Kit、TruSeq DNA Kit、HiSeq 2000 系统

• Zhang CZ, Adalsteinsson VA, Francis J, et al. Calibrating genomic and allelic coverage bias in single-cell sequencing. Nat Commun. 2015;6:6822

在单细胞DNA-Seq中，某些必要的DNA扩增法会引入序列杂峰，如MDA和多次退火环状循环扩增技术（MALBAC） 。在本研究中，作者研发了一种新的统计方法，用于定量评估由于WGA产生的单细胞DNA扩增偏差。通过比较MDA和MALBAC DNA文库，研究提供由MDA和MALBAC生成的单细胞文库的基准比较，并还确定了扩增水平下基因组范围偏差的普遍特征。该研究的统计模型可校正单细胞WGA数据中的等位基因偏差。

Illumina的技术：MiSeq 和 HiSeq 2500系统