2018-03-13

二，Illumina Hiseq 测序的相关内容

组成：

1，高精度显微光学扫描仪

2，一整套液流系统

3，计算机软硬件

4，温控系统

flowcell---lane---swath---tile---四张照片

如何从图像文件得到测序数据

1，扫描出来的初始文件是一个.tiff文件（图像文件），但是文件太大，只作为中间文件使用。

2，由软件对四张图片进行匹配，找到最合适的位置，ACTG是均匀存在的，易匹配。（若一些碱基特别多，一些碱基很少，那么一些图就特别亮，一些就特别暗，所以就会提供一些碱基平衡文库，如人类基因组文库或illuminate提供的标准的phix文库。

3，bcl文件难以阅读并很难改动，将bcl文件经bcl2FASTQ软件处理得到FASTQ文件。.CIF文件是可保留的图像文件(客户可以向测序公司提出保留.cif)，比.tiff小很多，Hiseq升级到v10以后，.cif文件保留被取消。

ACTG相对应的四种荧光素在四种波长的光下有四种不同的贡献率，组成一个4*4的贡献率表格，等于一个4元一次方四联方程。

phasing：主要是由酶活性不足引起的。如5000个序列同时测序，由于某些序列上碱基的延伸掉队的情况，循环次数越多掉队越多。

prephasing：碱基增添时比大部队超前的情况。是由于dNTP上的叠N基团掉了。

chasting：浓度最高的荧光素的量/（最高+第二高）。标准>0.6.

PF筛选：一条read的钱25个碱基中，最多只能有一个碱基chastiny<0.6.

Quality Score:

Pe:Possibility of error，即某碱基判读错误的可能性。

Q:Q30即出错的可能性为1/1000。

Q30比例：指在所有PF数据中达到或超过Q30标准的数据比例。

FASTQ文件中的Q值是+33转化ASCALL存入的。

FASTQ

1，序列目录,即该read来自哪个Hiseq，第几个RUN,第几个lane，第几个tile，及xy轴的位置。

2，碱基序列。

3，及其对应碱基序列的质量信息。