关于近红外荧光探针(IRB-NHS)检测试剂盒的常见问题解答

关于近红外荧光探针(IRB-NHS检测试剂盒的常见问题解答

[if !supportLists]1.    [endif]投量一般是按摩尔数比来算的,大概是需要接入氨基的个数的2倍投量。用这个方法换算的话,因为不知道 IRB-NHS 里面含有几个活性酯,所以具体的量无法确定。

答复:每个IRB-NHS中只有一个活性酯,但由于IRB-NHS本身水解作用,其投料比往往控制在伯氨基的1.5-2.0倍左右。

[if !supportLists]2.    [endif]标记抗体时,抗体与染料的投料比是多少?

答复:是1:3(摩尔比),大概每个抗体上可以标记1个左右荧光基团。

[if !supportLists]3.    [endif]想用这个染料修饰的材料的分子结构式中含有氨基(伯胺)和羧基,有两个问题:

[if !supportLists]1)    [endif]羧基会不会参与反应?如果会的话我需要如何处理?

答复:羧基不会参加反应,IRB-NHS只与待标记材料中的伯氨基反应生成稳定的酰胺键。

[if !supportLists]2)    [endif]这种染料在与伯胺反应后,水溶性如何,还会有何种水溶性基团。

答复:荧光基团本身含两个磺酸基,其水溶性很好,不会现在改变所标记材料的水溶性。

[if !supportLists]4.    [endif]该染料的分子结构信息,可否提供?

答复:母核是花菁类染料,可以提供其基本结构。

[if !supportLists]5.    [endif]关于“配制的DMF稀释液需立即使用。存放导致活性迅速丧失”这个说明,染料标记上靶分子以后,荧光可以持续多久?

答复:活性丧失主要是指活性NHS酯基基团破坏,无法与待标记材料商氨基键合,并非指荧光信号本身消失。连接上目标材料后,低温避光保存,固体状态荧光可以维持数月,液体状态数周。

[if !supportLists]6.    [endif]有一个实验方案如下:标记的是一个多肽,共61个氨基酸,大小为6.6KD。

[if !supportLists]1)    [endif]多肽溶于无菌PBS中,终浓度为10 mg/ml。

[if !supportLists]2)    [endif]将0.2mg IRB-NHS 粉末配置成  DMSO 溶液( 0.01 mg/uL)。

[if !supportLists]3)    [endif]将配置好的20ul染料立即逐滴分别滴加至200ul 10mg/ml 多肽溶液中,至于摇床,室温反应2 h。

[if !supportLists]4)    [endif]反应结束后,反应液加入超滤管中进行超滤( 4000 rpm,30×3min )取超滤管上层溶液。

[if !supportLists]5)    [endif]尾静脉注射SCID小鼠,100ul IRB-NHS-V5/mice

   请问这个方案合理吗?

答复:该方案基本合理。反应环境pH可以控制在7.4-8.3之间。IRB-NHS使用量(摩尔数)应为根据每条多肽期望的荧光基团个数的两倍量。另要确保多肽上有足够的伯胺基可以与NHS活性酯反应。另外,尽量避免多肽上功能区域的胺基与荧光基团反应从而影响多肽活性。反应结束后,建议纯化后观察材料颜色。成功标记后的材料应该呈深绿色。

[if !supportLists]7.    [endif]抗肿瘤抗体,190KD,想做近红外靶向成像实验,抗体和染料的比例是多少?在尾静脉100ul情况下打入的抗体应该控制到多少摩尔,多少质量会有比较好的成像效果?感觉最重要的环节就是比例和用量,不然小分子多的话靶向性真的体现不好,其他代谢部位都有扩散。

答复:一般每个抗体上标记2-5个近红外荧光分子就能够很好进行成像。抗体注射剂量与诊断和治疗目标有关,有很多文献可以查到!标记到抗体上的荧光基团由于数量很少,不会对抗体靶向性产生影响!

[if !supportLists]8.    [endif]激发波长对实验结果影响多大?有的仪器没有789nm的波长?

答复:最佳条件是在探针最大吸收处激发,但在730-780 nm处激发都有较强信号!

[if !supportLists]9.    [endif]感觉这个固体粉末是不时间稍久就会沾到管壁上,上次做的时候,用的是实验室师兄以前买的,但都沾到了管壁上,不能够实际称量,我就用DMSO溶解了,但感觉比例就加的不对了,染料可能加多了,胃肠处的荧光强度太强,都曝红曝白了

答复:活体注射是要摸索剂量的。该探针由于含有NHS基团,不宜长期存放,建议购买后3个月内使用!不能配成溶液后存放!

[if !supportLists]10. [endif]在染料和抗体偶联完后,三次超滤后仍见超滤下来的液体是绿色,是否为染料加入过多?是否要超滤到无色为止?

答复:最好超滤液中不要有明显绿色!但也有可能是滤膜不好导致抗体滤出导致颜色。

[if !supportLists]11. [endif]如果多肽分子量太小,1.5KD 用什么纯化方法比较好?可以用HPLC纯化吗?

答复:一般利用层析柱分析。根据分子量差异进行分离。探针分子量为800,所以很容易进行分离。

[if !supportLists]12. [endif]多肽是1400,不好分啊?cy5.5可以用HPLC不知道你们的这个可以不?HPLC对偶联后的多肽和IR影响大吗?

答复:1400和标记荧光基团后的2200还是可以用层析住分的。分子量还是差别较大的。也可以用HPLC分。不过更耗时一些。

[if !supportLists]13. [endif]1.4KD的多肽和IR783耦连后,如何把多余的IR783去除掉?具体一点的方法。

答复:利用标记前后分子量不同可以通过柱层析分离。

[if !supportLists]14. [endif]举个例子吧,如果我有一个多肽抗体,32KD,配制成2mg/ml的溶液与IRB-NHS结合,按1只小鼠的量,那我需要多少IRB-NHS,配制成多少量?

答复:探针标记剂量与抗体注射剂量有关,一般而言,每个抗体上标记2-3个探针就能够产生足够强的信号!根据需要注射抗体摩尔数就可以计算出需要标记多少探针!

[if !supportLists]15.[endif]反应好的溶液进行超滤,体积会减少,那最后需要保证多少体积?

答复:一般而言,纯化后的探针标记抗体保留在100-200微升PBS母液中,根据每只小鼠注射200微升体积进行稀释和注射!

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