PacBio Sequel概述

PacBio Sequel概述

概述

近年来，以PacBio测序为代表的第三代基因测序技术逐渐兴起。美国太平洋生物科学公司推出的三代测序又称作SMRT测序，即单分子实时测序，该方法基于纳米小孔的单分子读取技术，无需扩增即可快速完成序列读取。三代测序被广泛应用于基因组研究中始于2013年PacBio成功推出商业化的三代测序仪PacBio RSII。经过不断的改良和升级，PacBio公司在2015年10月推出全新升级的三代测序仪PacBio Sequel测序系统，其具有的长读长、高通量、高准确率等特点定将为研究领域带来全新的三代测序体验。得益于测序系统的优化和光学系统的缩减，Sequel系统变得更加灵巧，身体体积和重量仅为原来的1/3，相对于Illumina Hiseq的体积也缩小11%，但是增大了SMRT Cell运作空间，大大提高了数据产出，减少测序成本。

PacBio三代测序技术简介

SMRT测序的全称是Single Molecule, Real-Time Sequencing，即单分子实时测序，是PacBio推出的一项专利技术。顾名思义，SMRT技术核心就是能够实现单个DNA分子的测序，并且实时监控测序结果。

1.SMRT Cell

SMRT Cell是PacBio测序中用于DNA上样的芯片，样本完成建库后装载到Cell中才能进行上机测序。其概念可类比二代测序中经常提到的“Lane”。一次运行中（即一个Run），我们按照实验需求选择1 ~ 16个Cell进行测序。PacBio RS II系统配套的SMRT Cell数据产量为500 M ~ 1 G（每个SMRT Cell），新进升级的Sequel系统配套的SMRT Cell可产生5 ~ 10 G的数据（每个SMRT Cell），通量大大提升。

2 ZMW孔

零膜波导孔示意图

ZMW孔全称是Zero-Mode Waveguides，通常翻译为零模波导孔。Sequel测序仪的测序工作是以SMRT Cell为单位进行的，而每一个SMRT Cell中都含有大量这种圆形纳米小孔，直径为50 ~ 100 nm。该小孔利用了一种物理效应——零模波导，外径比激发光波长小，当DNA分子进入小孔后，因激发光从孔底发出的光不能穿透小孔进入上方的溶液区，仅被限制在底部一个足以覆盖被检测DNA部分的区域，进而收集该区域的信号，降低背景噪音。PacBio RS II使用的SMRT Cell中，每个含有15万个ZMW孔，而新Sequel平台配套的升级版SMRT Cell中，每个含有100万个ZMW孔，进而通量提升7倍。

3. SMRT建库

与二代测序不同，SMRT技术在得到片段化DNA后，会将片段粘末端变成平端，两端分别连接环状单链：单链两端分别与双链正负链 连接上，得到一个类似哑铃（“套马环”）的结构，称为 SMRT Bell。DNA酶就在这个闭合的DNA链中运动，达到对DNA正反链反复测序矫正的效果。

 

4.SMRT技术优势

单分子测序：可将某些复杂结构的DNA分子解开，进行准确的检测； 
测序读长：平均测序读长达到10 ~ 18 kb，最长可超过60 kb；
准确度高：测序深度达到30×时，准确度达到99.999%（Q50）；
敏感性强：可以检测频率在0.1%的Minor Variants；
无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一以及PCR Artifacts的产生；
较小的GC偏好性（GC bias）：在高GC和低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度；
可直接检测碱基修饰：利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，实现在测序的同时对碱基修饰进行直接检测。

5.SMRT测序应用

全长转录本测序
微生物&病毒复杂动态群体分析
环境微生物测序 
表观遗传学检测
全基因组de novo测序
基因组草图的优化或基因组完成图绘制
全基因组重测序&稀有变异鉴定
细胞器基因组测序

Sequel System特点与优势

测序通量增加7倍
测序成本显著降低
项目周期更短
配套的数据分析