南农Nature Microbiology一作顾少华：我与铁载体的这5年

我是顾少华，LorMe实验室的成员，今天是一个特殊的日子。

5年的辛苦终于有了回报。博士期间的研究工作成果以“Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizosphere microbiomes”为题发表在国际著名学术期刊《Nature Microbiology》（IF2018=14.3）。该成果揭示根际微生物铁载体介导根际菌群与土传病原青枯菌互作，在作物健康中发挥了关键作用。

其实不仅仅是文章发表本身，更重要的是从一个想法到团队协作，到取得突破，再到被国际专家认可的过程中，自己真实的成长，是值得开心的。

借着这个机会，给大家分享一下我在LorMe这5年的研究经历（注意：内容>10000字）。

第一章：初识铁载体

2015年4月一个阳光明媚的午后，我的导师徐阳春教授把我叫到他的办公室，当我走进徐老师办公室时发现小导韦中老师也在。就是这个午后，两位老师跟我提出了铁载体的研究课题。我清晰的记得当时韦老师跟我介绍了铁载体是微生物分泌的一种高效螯合三价铁离子的低分子量化合物，根际铁载体可能在介导根际微生物-病原菌以及根际微生物-植物互作中发挥着重要作用，但这一点目前尚不明确，需要我去探究。徐老师说这个方向与植物营养学、土壤学、微生物生态学等都有交叉，是值得突破的点。

那次谈话非常的简短，因为当时的我对铁载体可以说是一无所知，两位老师让我回去好好了解了解铁载体以及相关的研究背景。离开徐老师办公室后的我心情是复杂的，一方面我很庆幸可以得到两位老师的信任，将一个新的研究领域交给我去探索，另一方面我很害怕自己无法完成这个工作，因为我对铁载体几乎一无所知。不过，当时的我正好上完了研究生的所有课程，可以专心投入到自己的研究课题中了。

确定了课题，去查阅资料我倒不担心。因为从研究生入学复试结束后，我其实就算进入LorMe实验室了。实验室对文献阅读要求很多，尤其是微生物生态、进化等相关的。在进入实验室的一年里，我常常认认真真的跟师兄师姐们学习和交流，然后通过大量阅读文献更加全面客观的掌握相关知识。我非常积极主动的参与到师兄师姐的实验中，在实验的过程中一方面掌握相关的实验技能，另一方面通过与师兄师姐的交流了解研究背景、研究内容和研究意义。通过一年的积累和学习，我对实验室的研究已经有了比较全面的掌握。

不过当我在徐老师办公室听到铁载体时，却是如此陌生。这似乎不仅仅是我一个人的知识盲区，因为我走出徐老师的办公室，立马就去和实验室的师兄师姐们交流，他们只跟我说好像在文献中看到过siderophore（铁载体）这个名词，但都没有什么深刻印象。后面我又去打听整个大团队以及南农是否有专门做铁载体相关研究的人，可能是因为我交际圈的限制，我没有打听到一个专门做铁载体相关研究的人。此时的我开始意识到我未来的研究路上可能会比较孤独。但我偏偏是一个喜欢挑战的人，我喜欢接触新鲜事物，就这样，我开始了与铁载体五年的朝夕相处时光。

第二章：熟悉铁载体

首先介绍一下为什么我们要开展铁载体的研究。众所周知，由土传病原菌引起的作物土传病害是制约全球粮食优质高产和农业可持续发展的重要因素，其本质是不合理的集约化农业发展下土壤生态环境严重恶化、土壤微生物群落结构极度失衡和根际生态功能严重失调的必然结果。为恢复土壤微生物生态平衡，提升根际土壤生物功能，土壤学工作者需要阐明根际菌群-病原菌互作关系对土壤健康的贡献。LorMe实验室长期以细菌性病原青枯菌为模式病原菌，开展根际微生态与植物健康的研究。前期已从营养竞争、拮抗竞争两个方面详细论证了根际菌群内部竞争互作对植物健康有积极的意义，但我们很清楚土壤微生物之间不仅存在相互竞争的关系，也存在相互促进的关系。在开展根际菌群与土传病原菌互作研究中，韦老师一直有一个疑问？为什么病原菌单枪匹马能够成功入侵复杂的根际菌群？基于研究过程中的思考，韦老师认为土传病原菌作为土壤微生物中的一员，它能够在复杂的根际微生物环境中快速增殖，理论上有不少微生物提供了直接或者间接的帮助。土壤中除了有抑制病原菌的有益微生物，还可能有一些土壤微生物为病原菌的入侵提供了关键资源。而且提供的资源应该是微生物生长的必需品，并且在根际非常稀缺，因为，只有这样的资源才可能在复杂的根际菌群互作中发挥关键作用，进而影响根际健康。此外，如果根际微生物能提前占据这些稀缺资源，也可能会有效抑制病原菌的入侵。

通过大量的文献阅读发现，我慢慢明白为什么要研究铁载体了。第一，铁作为细胞生长代谢不可或缺的元素，其生物有效性（Fe³⁺）在环境中很低，根际微生物对Fe³⁺的竞争利用非常激烈，这样铁就符合稀缺和必需的要求，而且在环境中的形态单一。不像碳和氮等营养资源，虽然重要但在环境中形态多样。第二，为了获得稀缺的生物有效性铁，微生物会产生一种可以结合Fe³⁺的铁载体，来争夺环境中的铁，这样就有一个共同的获得铁的工具，可以用统一的方法来检测铁载体的产生。第三，虽然铁载体是公共物品，但由于铁载体具有相对的特异性，有些微生物分泌的铁载体不能被其他微生物利用，就形成了微生物间的拮抗竞争作用；有些微生物的铁载体受体蛋白能识别其它微生物产生的铁载体，那么这类铁载体就作为公共物质被其他微生物利用，形成了微生物间的便利促进作用，这样符合根际微生物促进或者抑制病原菌入侵的假说需求。

此外，关于铁载体的研究其实还蛮多的，一方面是偏应用的，往往是分离筛选有益微生物，铁载体产生作为一种促进植物生长的特性研究的，没有深入系统的探究；另一方面是偏生态和进化理论探究的，这部分往往聚焦在假单胞菌这个模式类群，铁载体结构以及相关基因突变体等信息和材料都比较完善，发表的文章也都非常好。还有一类是分析铁载体结构的，由于方法复杂，这类不多，主要是针对某些重要细菌来研究的。

由以上分析可知，在群落层面上研究铁载体的作用可以说基本是没有的。说明我们选择的角度还是可以的。2015年8月，韦老师从国外给我打了一个QQ电话，说在一个国际会议上，看到有人在做大量细菌产生铁载体的研究。“从土壤和湖水中分离了几百株假单胞菌，非常有意思，文章还没有发表。我们根际微生物种类非常复杂，我们不能仅仅聚焦在假单胞菌，应选择更多类群才能有代表性，并且用几千个细菌，这样在未来几年工作发表时才可能有竞争力”。后来那个工作2017年发表在Nature Communications上，我认真的阅读了，的确是非常棒的工作。3年后我们的工作发表在Nature Microbiology上，证明韦老师这个决定是正确的。

第三章：与铁载体的门外接触

既然生物有效性铁非常有限，并且微生物主要通过产铁载体来争夺利用有限的铁，那么铁载体必然会影响群落互作关系，可推断微生物铁载体调控根际菌群与病原青枯菌的竞争或便利互作关系，进而影响病原青枯菌的入侵，这一问题并没有答案。第一，不清楚根际细菌是否都能产生铁载体，它们产铁载体的能力如何？也不清楚产生的铁载体到底对青枯菌生长有什么影响，哪些微生物产生的铁载体抑制了病原菌的入侵？哪些微生物产生的铁载体促进了病原菌的入侵？基于这些简单的小问题，我开始了我的铁载体研究之路。

研究伊始，我和王孝芳开始了为期三个月的分离根际可培养微生物的工作。我们各自负责自己的研究课题，但是却通力合作，我负责分离根际土壤样品中的细菌；王孝芳负责分离根际土壤样品中的噬菌体、病原青枯菌（她的部分工作已经发表在了著名国际期刊Nature Biotechnology上）。在这里我要感谢一下王孝芳同学，和优秀的人在一起让我学习很多，我有一个习惯自我感觉还算不错，我比较善于发现别人身上的优点并进行学习，我坚信并笃行“三人行必有我师”。经过三个月的努力，我从番茄根际随机分离、纯化了2000多株根际细菌（图1）。在这里我要感谢LorMe的全体小伙伴，在纯化菌株的过程中得到了实验室全体小伙伴的鼎力相助，将2000多株根际细菌多次划线纯化这么大的工作量，没有实验室小伙伴的帮助，是不可能这么快就完成的。竞争求发展，合作谋共赢，在LorMe文化的熏陶下，这些大工程得到了顺利完成。

分离、纯化根际细菌的平板（ 爱LorMe）

后来的16S rRNA基因鉴定结果显示，这次分离的细菌代表性还不错。主要隶属于4个门35个科和83个属，其中变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria），分别占细菌总分离数的50%、24%、18%和8%。几个丰度较高的属为芽孢杆菌属（Bacillus）、大肠杆菌属（Enterobacter）、金黄杆菌属（Chryseobacterium），丰度分别占总细菌分离数的19%、15%和14%，这三个属的总比重达到了48%。

辛苦了几个月，还在铁载体的门外。这些是不是根际细菌都能产生铁载体？产生量是否有差异？产生的铁载体对病原青枯菌生长有什么影响？ 这些简单问题还没有回答。

第四章：LorMe的团队力量

问题简单，开展起来却不容易。我们需要得到2000多株根际细菌在限铁和富铁条件下的发酵液以及测定发酵液中铁载体的含量以及发酵液对青枯菌生长的影响，每个菌株还要有3个重复。经过详细的计算之后（准备培养基、分装到离心管、编号、摇种子液、编号、接菌、培养、编号、离心、编号、过滤、编号、分装、接菌。。。）*几千，我很沉重地告诉韦老师，“如果我一个人开展工作，可能需要一年不休息，完全占据实验室的几个设备，才可能把这个实验完成，而且还不知道结果如何”。

韦老师可能注意到我的担忧和不安，他说他来安排，让我先准备各种实验材料。之后他开了一次实验动员会，把他所带的2013级本科学生（韦中老师为班主任）也召集过来。韦老师详细讲解了这个研究的重要性和挑战，并认真分析了实验流程，对任务进行了拆解，找到实验过程中的瓶颈问题。一次性配几十升培养基，准备几万的各种枪头、离心管、过滤器等已经不是难题。在计算分析的过程中，我们发现离心是个重大瓶颈，因为一个小离心机也就20个孔左右，一个离5分钟，一小时也就离100个样品，每天1000个样品，也要10个小时。离心只是一个小环节，不能卡在这里。后来就决定把整栋楼能借的小离心机都借过来，这样就保障2小时以内完成离心任务。最后，这次实验分了三批，用3个星期完成了。本次预实验的结果给了我很大的信心，简单的数据规律符合我们的初步预期，是我继续开展正式实验的基础。通过这次预实验的开展，我对整个实验流程和设计有了更加清晰的了解，也发现了一些可以改进的地方。韦老师也更新了实验设备，比如把培养、离心和过滤都在96微孔板体系操作，实验能可控，更省力省时省钱。后面重复这个实验时，我一个人再加上偶尔1-2个帮手，2个月也就完成了（高通量设备真的很重要，不然我肯定坚持不下去）。在此我感谢参与到本次实验中的所有人，尤其是已经毕业的2013级资环131班的同学，这次预实验能够如此高效的完成离不开你们每一个人的帮助。

本科生和实验室小伙伴一起开展预实验的场景

第五章：疯狂的战斗

正式实验的开展是在2016年的暑假，因为那个暑假LorMe的大部分学生都去宜兴基地布置和开展温室盆栽实验了，所以留在学校的学生非常少。因此，这个暑假两个月的时间里，我几乎一个人占有了一整个实验室（B603实验室）。我深知自己的实验需要很大的实验室空间和占用很多的实验室资源，所以为了不影响别人实验的开展，这两个月是开展和完成我实验的最佳时间。我必需非常珍惜这样难得的两个月，因此这两个月我的实验安排的非常紧凑，几乎除了去学校食堂吃饭和晚上几个小时的睡觉时间外，我从未离开过实验室。徐老师的办公室就在实验室的斜对面，在暑期的两个月，徐老师几乎天天都会来实验室检查实验室安全问题，所以这两个月我和徐老师几乎天天可以碰面。我还清楚的记得，暑期结束后的第一次组会，徐老师表扬了我，打趣的说我耐得住寂寞，可以一个人静下心来在实验室如此高效的完成这样一个实验。

根际分离细菌发酵液对青枯菌影响实验的96孔板

我们用CAS法测定2000多株根际细菌分泌的铁载体的相对含量，结果显示高达95%的根际分离细菌产生了铁载体，并且在限铁条件下铁载体产量明显提高。限铁条件下根际细菌产生的铁载体能力与其生长能力正相关，但在富铁条件下不相关。这些结果表明，铁载体的生产是根际细菌间存在的普遍现象，并且对于限铁条件下的细菌生长很重要。随后，我们评估了来自不同菌株的铁载体对病原青枯菌生长的影响。我们首先将从富铁条件下收集的细菌无菌发酵液（不含或者仅含少量铁载体，主要含有除铁载体以外的其他代谢产物）添加到富铁条件下去培养青枯菌，我们发现这些发酵液对青枯菌生长的作用比较温和，且以促进作用为主。而将根际细菌在限铁条件下得到的无菌发酵液（含有大量的铁载体和其他代谢产物）加入限铁条件下去培养青枯菌时，我们发现这些发酵液对青枯菌的生长具有更为强烈的影响（抑制或者促进），这些影响的范围从几乎完全抑制到高水平的促进作用。为了验证观察到的富铁和限铁条件之间的生长效应差异是否确实是由铁载体而不是由其他代谢产物变化引起的，进一步将2000多株根际细菌在限铁条件下得到的发酵液补足铁（铁载体被螯合），并将补足铁的发酵液加入到富铁条件下培养青枯菌，在此条件下由于铁充足，铁载体无法发挥作用，因此主要是其他代谢产物介导的作用。研究发现，限铁条件下其他代谢产物介导的根际细菌对青枯菌的作用和富铁条件下发酵液介导根际细菌对青枯菌的作用无显著差异，这表明铁载体是铁限制条件下细菌相互作用的主要驱动力。确实，当估计铁载体的净效应时，我们发现铁载体解释了发酵液介导的对青枯菌的总生长效应的76%。有了这个结果，整个项目就可以继续推进了。

根际分离细菌在限铁和富铁条件下铁载体的产生情况（a）以及铁载体产量与根际细菌生长之间的相关性（b）；不同铁素处理下根际细菌发酵液以及铁载体对青枯菌生长的作用（c）和限铁条件下铁载体和总代谢物质介导的根际细菌对青枯菌生长的作用之间的相关性（d）

这里还是补充一点，其实数据分析没有那么顺利。之前埋头做实验，数据分析少，一下子面对这么大的数据，我其实非常头大：拿到实验数据，不知道怎么分析，R语言不熟。韦老师问我结果呢，我说还在分析，找不到突破点。后来韦老师着急了，喊我带着数据到他办公室。大概半个小时吧，他把一个相关性分析结果展示给我看，铁载体产生与对青枯菌生长能力影响。“看到这个现象就行了，可以继续推进工作了”。

第六章：战斗之后的迷茫

“科学问题简单，试验本身简单，甚至是单调的重复，数据量大不好分析，工作的重要性把握不准，工作方向摸不清楚。”后来一次组内交流中，韦老师以我的工作和研究生交流了一下。他说，这时候研究生容易有思想波动，需要适当的心理建设。最重要的法宝是反复和大家交流工作的意义，研究的思路，让研究生从内心深处认可自己的工作，并为之努力。

我的经历就是典型案例。

研究思路可能对于韦老师来说是清晰的，其实我那时开始进入研究的瓶颈期，这应该持续至少半年时间。这半年我开始陷入自己的思想误区（【LorMe特刊】不要陷入自己的思维怪圈里），开始对自己的研究感到陌生和迷茫，最可怕的地方是我开始排斥和导师交流了。现在分析之所以排斥和导师交流或者对自己的研究感到迷茫，主要原因是自己的研究思路没有打开，不知道该跟导师交流什么，因此产生了逃避心理。虽然内心有所逃避，但我并没有浑浑噩噩的度日，我依然在大量阅读相关文献，试图打开自己的思路。但我已然进入了自己的思想误区，现在的我很明白，如果没有韦中老师的引导，我很难靠自己走出来。我能打开自己的思路，还离不开两位外国学者的耐心指导，他们分别是荷兰乌特勒支大学的Alexandre Jousset博士和英国约克大学的Ville-Petri Friman博士。韦老师多次让我将研究思路和已有的研究结果与两位外国学者进行交流，在交流的过程中他们根据已有的结果给了我很多指导建议，并且肯定和完善了我们的研究思路。这次交流让我深刻的意识到学术交流的重要性，不管在研究的过程中遇到怎样的问题，一方面是自己的独立思考，另外一方面一定要积极主动的和导师或者其他研究学者交流，从不同的角度评估自己工作的不足和工作的亮点。我认为独立思考固然重要，但交流的重要性并不比独立思考低，因为别人的一句话可能如醍醐灌，让你顶豁然开朗。虽然徐老师和韦老师以及两位外国学者对我的指导和帮助伴随着我整个研究生生涯，但这段时间的指导对我显得格外深刻。

Alexandre Jousset博士和Ville-Petri Friman博士

第七章：柳暗花明

虽然有些迷茫，但是还是坚定地跟着导师走，做一些简单数据分析工作。比如哪些分类地位的细菌产生的铁载体多，哪些细菌产生的铁载体对青枯菌是抑制或者促进作用？是否存在一些遗传驱动机制？慢慢的数据分析能力提升了，找到了一些有意思的现象。比如大肠杆菌属（Enterobacter）和金黄杆菌属（Chryseobacterium）总体产生铁载体的能力特别强，对青枯菌也有很强的抑制能力，而芽孢杆菌属（Bacillus）总体产铁载体能力弱，对青枯菌生长也总体是促进作用。分析到这里也吓我一跳，因为这个跟之前的常识有些不太一样。大家之前都说芽孢杆菌是有益微生物，能抑制病原菌，而我的研究发现大部分芽孢杆菌都有可能促进病原菌生长（产生的铁载体能被病原青枯菌利用，间接成为病原的帮凶）。不过这一结果也恰恰说明了微生物的世界很复杂，我们的了解还太少。

我们检查了细菌分类学的隶属关系是否可预测铁载体的生成以及铁载体介导的对青枯菌生长的作用。研究发现发现两种性状均具有显著的系统发生信号（铁载体产生的C_mean：0.262，铁载体介导的对青枯菌生长作用的C_mean：0.148，两种性状的p <0.001），该信号相对较弱（C_mean = 1表示所有观察到的变异由系统发育学解释），这表明在相关根际分离细菌之间铁载体的产生和铁载体介导的作用均可能存在差异，这些差异可能是由于最近的变化、性状功能的获得或丧失导致的。对18个最常见属的集中分析证实，共同祖先和属内差异均会导致性状变异：（a）某些属（例如比较肠杆菌和芽孢杆菌）在铁载体的产生及其对青枯菌生长的影响程度上存在属间差异；（b）这两个性状的属内（例如芽孢杆菌属）分离株之间的变异也很大。我们将根际细菌与青枯菌的系统发育距离和铁载体产生用于综合预测铁载体介导的根际细菌对青枯菌生长的作用，发现抑制作用最强的是与青枯菌系统发育距离相对较近并产生大量铁载体的分离株。这种系统发育效应与生态学理论相一致，生态学理论中强调，密切相关的物种之间因为生态位的重叠的可能性更高，因此资源竞争更剧烈。

根际分离细菌分类地位与铁载体产生及作用之间的关系（a）；18个丰度较高属的根际分离细菌铁载体产生和作用情况（b）；根际分离细菌与青枯菌之间的系统发育距离、铁载体的产生以及铁载体介导的作用之间的关系（c）

第八章：啃下硬骨头

前面我们明确了铁载体对根际细菌和青枯菌生长的影响，但都是用发酵液来研究的，但是这些结果是否能够解释根际细菌与病原青枯菌共存时的规律呢？这是理论与实际结合的最关键步骤。

第一步是实验共培养实验，工作比较简单，就是工作量大。我们分析了限铁共培养条件下2150个根际分离细菌与青枯菌之间直接竞争的结果。我们发现如果根际细菌产生抑制性铁载体，共存时青枯菌生长的就差；如果产生便利型铁载体，共存时青枯菌生长的就好。由于根际细菌种类复杂，很难检测所有细菌在共存时的丰度，韦老师建议重点以芽孢杆菌为例，看看芽孢杆菌在与青枯菌共存时的变化。同样我们发现如果芽孢杆菌产生抑制性铁载体，其自身生长就好一些，反之就生长的差。对这一结果的合理解释是铁载体介导的效应决定了根际细菌与青枯菌的铁素竞争力，当铁载体介导促进效应时，根际细菌的铁素竞争力弱，分泌的铁载体被青枯菌剥削利用，促进了青枯菌的生长，而自身分泌铁载体消耗了大量的能量却无法回收自己的铁载体获得铁素营养，因此生长受阻；而铁载体介导抑制效应时，根际细菌的铁素竞争力强，分泌的铁载体将环境中微量的铁素营养固定住，供自己使用，可以保障自己更好的生长，而青枯菌利用铁素营养受阻，生长受到抑制。

那么这一效应是否可以解释田间根际细菌和青枯菌的共存模式呢？如果可以也是一个重大突破，因为把室内工作与田间现象关联了起来。我们使用了整个微生物组群落的16S rDNA测序和qPCR来估计每个根际分离细菌与青枯菌在80个土壤样本中的共存能力。我们发现，产生抑制作用铁载体的根际细菌趋向于与青枯菌具有强共存能力（根际细菌丰度与病原菌数量呈正相关），而产生促进作用铁载体的根际细菌与青枯菌的共存能力较弱。这一发现也让很多人吃惊，包括审稿人也让我们再解释清楚一些。一般认为竞争结果是一个受益（种群数量增加），一个受损（种群数量下降），负相关应该是体现竞争关系，但是这里为什么说便利促进效应呢？根际细菌丰度与病原菌数量呈正相关为什么是根际细菌共存竞争能力强呢？我也是在韦老师的反复解释下明白的：青枯菌的入侵，以及种群数量的激增是有寄主优势的，没有强大的外力和前期及时的扼杀，病原菌种群数量增加是不可逆的。病原菌种群数量的激增必然需要大量资源的支撑，C和N等资源土壤-植物系统可以提供，但是稀缺的必须元素铁只有争夺。只有产生铁载体能力强，并且产生的铁载体不能被激增的病原菌群体利用，这样的根际细菌种群才能在根际中利用C和N等其他资源，进而保持较高的种群数量。那些产生能被病原菌利用的铁载体的细菌，只能被剥削，消耗了自己的能量，铁载体被激增的病原菌种群利用，种群数量自然很低。所以与病原菌种群数量的正相关，正是说明根际细菌的强共存竞争能力。此时我们明确了铁载体是根际细菌与病原菌争夺根际核心稀缺资源铁素的秘密武器。

室内限铁条件下根际细菌与青枯菌共培养时青枯菌的生长与铁载体介导的作用之间的关系（a）；田间条件下铁载体介导的作用与根际细菌与青枯菌共存能力之间的关系（b）

第九章：最后一战

那么这些强共存竞争能力的细菌是否可以为我所用，保护植物健康呢？这个问题正是我要最终回答的。做完这个，我就可能找到对付土传青枯病的一些办法。

2018年，我在有机固体废弃物资源化协同创新中心（宜兴）完成了这个工作。这又是一个大工程，360个根际细菌，几千棵番茄。温室盆栽实验保质保量的完成离不开LorMe成员的帮助，我们几乎所有的实验都是全员出动，共进退，互帮互助。那一年暑假我的工作量是最大的，尽管别的学生也有很重的实验安排，但几乎所有当年的新生（没有自己的实验安排）主要都是在协助我开展温室盆栽实验。徐老师在宜兴指导我们工作的时候特别强调温室盆栽实验的水分管理至关重要，一定要尽量保证每棵苗的土壤水分保持一致，因为水分对实验结果的影响很大。这就要求我们浇水的时候要特别细心，一棵苗一棵苗的进行定量浇水，一个人负责10车必然不能做到良好的水分管理，于是我给新生布置了任务，加我一起五个人，每个人负责2车的水分管理。尽管如此每天晚饭后去浇水，我们几乎每次都需要花费一个小时的时间。温室出现第一颗发病植株后，我们还需要每天记录温室的发病率，加上每隔三天我们需要将盆栽随机打乱位置，所以几乎每天都会有一群人在夜深的时候行走在温室回工程中心的路上。我清晰的记得温室实验结束的那一天，我们全体在宜兴的LorMe成员采集和整理我温室盆栽实验的根际土壤样品，从早到晚除了吃饭时间一刻也没有休息，一直奋斗到凌晨1点才回宿舍休息。这些日子显然是辛苦的，但是回忆却是如此的美好，再次感谢所有一起在宜兴奋斗过的小伙伴。

温室实验得以顺利完成也离不开宜兴沈主任的无私帮助，沈主任负责管理宜兴所有的学生，他经常发动学生进行协同合作，哪个学生有需要，只要跟沈主任说一下，主任就会组织安排学生进行互帮互助。沈主任不仅仅只是负责安排，他总是亲自带头上阵，在温室经常可以看到主任忙碌的身影，今天帮这个学生，明天帮那个学生，沈主任这一优秀品质深深的感染着我。沈主任经常跟我讲，一定要学会团队合作，一个人的力量是薄弱的，但是团队的力量是惊人的，在宜兴的2个多月的时间里，沈主任的言传身教，让我学习很多，受益匪浅。

温室盆栽实验10车番茄植株，我和沈主任（右）在温室合影，徐老师在温室指导学生

温室盆栽实验的结果显示，铁载体介导的相互作用与青枯菌生长和植物保护均显著相关。具体而言，当预先接种的根际分离细菌产生促进性铁载体时，病害发生率和根际青枯菌数量较高，而当植物预先接种的根际分离细菌产生抑制性铁载体时，病害发生率和根际青枯菌数量较低。此外，根际青枯菌数量与病害发生率呈正相关，表明抑制青枯菌生长在病害防控中起关键作用。尽管本研究发现的关联都很重要，但我们必须要意识到它们仅解释了所观察到的总变异的相对较低水平。这表明除铁载体以外的其他因素也影响病原菌的侵染结果。总而言之，我们的温室实验与体外和田间观察到的青枯菌生长以及根际细菌与青枯菌的共现模式均非常匹配，表明铁载体介导的作用可以预测根际细菌对病原菌的抑制和病害的发生情况。

铁载体介导的作用与感病成功与否（a）、感病程度（b）和根际青枯菌的数量（c）之间的关系；根际青枯菌数量与感病成功与否之间的关系（d）

第十章：写在最后

到这里，我的研究生课题工作就差不多了。在后期的数据分析、论文撰写过程中我也提升很多。这里还想特别感谢另外两位在我科研路上给予我极大帮助与支持的外国学者，他们是瑞士苏黎世大学的Rolf Kümmerli教授和Jos Kramer博士，这两位学者在假单胞菌铁载体介导的微生物生态和进化方面拥有丰富的研究经验和扎实的研究基础，在系统发育分析和论文写作等方面，他们给我提供了很多的指导和帮助。2017年当Rolf的Nature Communications文章发表时，听韦中老师说，Rolf就是他2015年在欧洲进化生物学会议上认识的，当时只握了一下手，告诉Rolf未来几年会开展铁载体相关的工作，希望有机会再请教他。三年后，韦老师在欧洲访学期间，在国际微生态大会再次与Rolf碰面交流，之后又专程跑去苏黎世大学与他进行了面对面的交流，建立了良好的合作基础。韦老师说，铁载体对我们来说是一个新的领域，跟最棒的人学习才能进步的快。

Rolf Kümmerli教授和Jos Kramer博士

铁载体的发现感觉就像宝藏挖掘的过程，前面很长一段路都非常苦，而且看似都没有希望。但你必须不断的坚持，不断的更新学习和交流，才可能在不熟悉的领域闯出一条路，拿到宝石。

不要忽视平台的力量，不要孤军奋斗，我深知我的收获离不开多方面的支持；有时也必须学会独自战斗，自己没有蜕变，是无法体会收获的喜悦的。

引用韦老师2020年1月对我的一个总结，“2015年开始铁载体工作，2年后少华还在晕乎乎，2018年才开始明白，2019年已经很棒了，2020年他基本准备好了”。我觉得总结的非常到位，我想也只有在整个过程中悉心陪我走下来的老师才有可能做到这个精确的总结。我的铁载体研究生涯才刚刚开始，马上要步入一个新的阶段，我会带着研究生期间的所感所悟，努力前行。

感恩学校、学院的培养，感恩土壤微生物与有机肥团队大平台老师的关心和指导，感恩LorMe，感恩徐阳春老师，韦中老师，所有帮助我的同学和朋友以及我的家人。

LorMe集体照片

顾少华个人简介

顾少华，男，29岁，江西上饶人。2014年6月毕业于湖南农业大学，南京农业大学2014级硕博连读生，主要开展铁载体与根际微生态相关工作。2017年在南京农业大学直博生论坛中表现优异获得研究生院的短期访学项目资助，前往美国威斯康星大学短期交流。2018年获得江苏-英国高水平大学20+20行动计划定制项目资助，前往英国约克大学短期访学。2019年获得南京农业大学博士论文创新工程，一等资助。博士期间发表第一作者文章两篇：Nature Microbiology和mSystem（小修）。

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编辑|顾少华、韦中

排版|尹悦

校对|LorMe团队

封面|张耀予

南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队

微生态与根际健康实验室

Lab of rhizosphere Micro-ecology

立足国家需求，探索学科交叉，引领国际前沿

开展微生态研究、致力于根际健康提升、培养一流创新人才

竞争求发展，合作谋共赢Competition & Cooperation

感谢您的关注和支持！

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