Trimmomatic：用于Illumina NGS数据的灵活读取修剪工具

数据质控软件：
官网：http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic
手册：http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/TrimmomaticManual_V0.32.pdf
个人觉得，直接看上面pdf，然后尝试提交一个代码，理解代码的参数含义，比较质控前后fastqc的结果就可以完成学习了。但是首先你要明白质控在做哪些事情？什么是接头，什么是N。。。

安装

conda安装

$ conda create -n rna3 python=3
$ source activate rna3
$ conda install trimmomatic
$ trimmomatic --help
Usage: 
       PE [-version] [-threads ] [-phred33|-phred64] [-trimlog ] [-summary ] [-quiet] [-validatePairs] [-basein  |  ] [-baseout  |    ] ...
   or: 
       SE [-version] [-threads ] [-phred33|-phred64] [-trimlog ] [-summary ] [-quiet]   ...
   or: 
       -version
$ trimmomatic -version
0.39

二进制源码安装

$ wget -c http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/Trimmomatic-0.39.zip
$ unzip Trimmomatic-0.39.zip
$ cd Trimmomatic-0.39/
$ java -jar trimmomatic-0.39.jar
Usage: 
       PE [-version] [-threads ] [-phred33|-phred64] [-trimlog ] [-summary ] [-quiet] [-validatePairs] [-basein  |  ] [-baseout  |    ] ...
   or: 
       SE [-version] [-threads ] [-phred33|-phred64] [-trimlog ] [-summary ] [-quiet]   ...
   or: 
       -version
$ alias Trimmomatic="java -jar /home/qmcui/Trimmomatic-0.39/trimmomatic-0.39.jar" 
# 可以写入.bashrc里，永久有效
$ Trimmomatic --help

双端任务1

$ Trimmomatic PE  \
/teach/project/1.rna/2.raw_fq/SRR1039510_1.fastq.gz  \
/teach/project/1.rna/2.raw_fq/SRR1039510_2.fastq.gz  \
./output_forward_paired.fq.gz ./output_forward_unpaired.fq.gz  \
./output_reverse_paired.fq.gz ./output_reverse_unpaired.fq.gz  \
ILLUMINACLIP:adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10:2:keepBothReads \
LEADING:3 \
TRAILING:3 \
MINLEN:36 \
$ ps -ef|grep qmcui

结果

TrimmomaticPE: Started with arguments:
 /teach/project/1.rna/2.raw_fq/SRR1039510_1.fastq.gz /teach/project/1.rna/2.raw_fq/SRR1039510_2.fastq.gz output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10:2:keepBothReads LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36
Multiple cores found: Using 4 threads
Using PrefixPair: 'TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT' and 'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT'
ILLUMINACLIP: Using 1 prefix pairs, 0 forward/reverse sequences, 0 forward only sequences, 0 reverse only sequences
Quality encoding detected as phred33
Input Read Pairs: 22852619 Both Surviving: 22393983 (97.99%) Forward Only Surviving: 285634 (1.25%) Reverse Only Surviving: 138619 (0.61%) Dropped: 34383 (0.15%)
TrimmomaticPE: Completed successfully
# 时间8min，输入read1和read2压缩文件为1.3G，均为91410476条reads

双端任务2

# Trimmomatic等于java -jar trimmomatic-0.35.jar 
$ Trimmomatic PE -phred33 \
input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz \
output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz \
output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz  \
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
LEADING:3 \
TRAILING:3 \
SLIDINGWINDOW:4:15 \
MINLEN:36

单端任务1

java -jar trimmomatic-0.35.jar SE -phred33 input.fq.gz output.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

参数解释

ILLUMINACLIP 去除adapter，后面有6个参数；如adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10:2:keepBothReads （index.fa、错配个数2、比对分值30、最低比对分值10、切除接头最短序列2（default8）
、keepBothReads设置为true还是false（双端序列最好加上，再比如bowtie下游处理软件必需））
LEADING:3 去除领先的低质量或N碱基（低于质量3）
TRAILING:3 去除拖尾的低质量或N个碱基（低于质量3）（TRAILING：3）
SLIDINGWINDOW:4:15 使用4个底宽的滑动窗口扫描读数，当每个基础的平均质量降至15以下时切割
MINLEN:36 丢掉长度小于36nt长的reads

全部参数

不理解滑窗的可以适当google了解一点

# --help出现的参数
[-threads ] 控制线程数，如果不提供，自动选择
[-phred33 | -phred64] illumina的锅，目前数据测得都是-phred33
# 你可以去网上搜索一段代码，怎么判断自己的数据是phred33还是phred64
# 运行任务的时候，提示信息里会出现程序判断的数据类型，显示信息如下
# Quality encoding detected as phred33
[-trimlog ] 对每条reads出一条log，一般不用这个参数，日志条数太多了
[-basein  |  ] 输入文件
[-baseout  |    ] 输出文件，注意顺序

## 其他调节参数
ILLUMINACLIP：从读取中剪切适配器和其他Illumina特定序列。
SLIDINGWINDOW：执行滑动窗口修剪，一旦窗口内的平均质量低于阈值，就切割。
LEADING：如果低于阈值质量，则在读取开始时切断碱基
TRAILING：如果低于阈值质量，则在读取结束时剪切碱基
CROP：将读取切割为指定的长度
HEADCROP：从读取开始剪切指定的碱基数
MINLEN：如果读取低于指定长度，则删除读取
TOPHRED33：将质量得分转换为Phred-33
TOPHRED64：将质量得分转换为Phred-64

-trimlog

指定trimlog文件会创建所有读取修剪的日志，指示以下详细信息：

the read name
the surviving sequence length
the location of the first surviving base, aka. the amount trimmed from the start the location of the last surviving base in the original read
the amount trimmed from the end

ILLUMINACLIP:

为TruSeq2（用于GAII机器）和TruSeq3（用于HiSeq和MiSeq机器）提供，用于单端和双端模式。这个有仪器决定，一般你用的PCR的接头的试剂盒。

ILLUMINACLIP：：<种子不匹配>：：<简单剪辑阈值>

fastaWithAdaptersEtc：指定包含所有adapters，PCR序列等的fasta文件的路径。(the path to a fasta file containing all the adapters, PCR sequences etc.)
seedMismatches：指定仍允许执行完全匹配的最大不匹配数目，如2
palindromeClipThreshold：指定两个“适配器连接”读取之间的匹配对于PE回文读取对齐的准确程度。
simpleClipThreshold：指定任何适配器等序列之间的匹配必须与读取的准确程度。

SLIDINGWINDOW::

滑动窗口：：
windowSize：指定平均值的基数
requiredQuality：指定所需的平均质量。

LEADING:

LEADING：<质量>
quality：指定保持基础所需的最低质量。

TRAILING:

TRAILING：<质量>
quality：指定保持基础所需的最低质量。

CROP:

CROP：<长度>
length：从读取开始时要保留的碱基数。

HEADCROP:

HEADCROP：<长度>
length：从读取开始时删除的碱基数。

MINLEN:

MINLEN：<长度>
length：指定要保留的最小读取长度。

输入文件要求

For input and output files adding .gz/.bz2 to an extension tells Trimmomatic that the file is
provided in gzip/bzip2 format or that Trimmomatic should gzip/bzip2 the file, respectively.

双端输出文件要求

对照着--help的4个文件理解输出文件
For paired-end data, two input files, and 4 output files are specified, 2 for the 'paired' output
where both reads survived the processing, and 2 for corresponding 'unpaired' output where a
read survived, but the partner read did not.

mySampleFiltered_1P.fq.gz - for paired forward reads
mySampleFiltered_1U.fq.gz - for unpaired forward reads
mySampleFiltered_2P.fq.gz - for paired reverse reads
mySampleFiltered_2U.fq.gz - for unpaired reverse reads

Trimmomatic：用于Illumina NGS数据的灵活读取修剪工具_第1张图片

image.png

质量值类型：自动选择

以前版本默认64，现在版本自动根据数据来做判断
-phred33 or -phred64 specifies the base quality encoding. If no quality encoding is specified,it will be determined automatically (since version 0.32). The prior default was -phred64.

线程数：自动选择

-threads indicates the number of threads to use, which improves performance on multi-core
computers. If not specified, it will be chosen automatically.

结束

修剪按照在命令行上指定步骤的顺序进行。在大多数情况下，建议尽可能早地完成适配器剪辑。