TET1突变可以作为肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的潜在标志物

Alteration in TET1 as potential biomarker for immune checkpoint blockade in multiple cancers

（TET1突变可以作为肿瘤ICI治疗的潜在标志物）

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1.背景介绍：

靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1途径的免疫检查点抑制剂（ICI）在治疗不同类型的癌症中取得了令人瞩目的成功。但是，临床反应各不相同，目前，PD-L1表达，高微卫星不稳定性（MSI-H），肿瘤突变负担（TMB），和特定突变基因在预测ICI治疗反应者中显示出预测性效用。然而，迄今为止，只有PD-L1和MSI-H已通过临床验证。因此，迫切需要更多可预测的生物标志物。越来越多的证据指向DNA甲基化和肿瘤治疗之间的联系。最近有报道称DNA甲基化标记物与PD-1治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）的功效有关。然而，迄今为止，缺乏关于DNA甲基化相关基因的基因组改变与ICI反应的关联的临床证据。在这项研究中，作者系统地收集和合并大量基因组和临床数据，以评估DNA甲基化关键基因突变对ICI治疗的预测作用。作者发现，DNA羟甲基化酶TET1中的突变在ICI治疗的肿瘤患者有着更好的临床获益，更长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。

2.数据和方法：

2.1 数据来源

作者的数据分为发现队列、验证队列（由Samstein等人数据组成，来自MSKCC数据库）、TCGA数据、cBioPortal网站过滤后的数据整合。

Fig1a图是发现队列：来自于六个已经发表的研究数据的529例病例，排除了癌症类型数量少于10名的患者（n  = 3）和接受除ICI之外同时接受其他治疗的患者（n  = 7）后，最终发现队列共纳入519例数据。主要为MSK-IMPACT panel测序以及全基因组测序（WES）。

Fig1b图是验证队列：MSKCC数据库里Samstein等人的数据，分为未经过ICI治疗（2252例）和经过ICI治疗的（1395例），最终验证队列共纳入3646例数据。

TCGA数据（补充图）：

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cBioPortal网站过滤后的基因组数据（补充图）：

2.2 不同临床数据TMB的标准化

TMB定义为所检查基因组的每兆碱基（Mb）的非同义体细胞，编码，碱基取代和indel突变的总数。对于通过WES测序的样品，非同义突变的总数通过覆盖足够深度的兆碱基进行归一化；对于以MSK-IMPACT panel进行测序的样品，将识别出的非同义突变的总数标准化为MSK-IMPACT panel的外显子覆盖率（在341-, 410-, 468-gene panels分别0.98, 1.06, 1.22 Mb）

2.3 临床结果评估指标

主要临床结果为ORR，DCB，PFS和OS。

• ORR：使用实体瘤反应评估标准（RECIST）1.1版评估ORR。

• DCB：分为持续性临床获益（DCB；持续> 6个月的完全缓解CR /部分缓解PR或稳定疾病SD）或没有持久性受益（NDB，持续的疾病进展PD或SD ≤6个月）。

• NE：未进展且在随访6个月之前接受检查的患者被视为不可评估（NE）。

• PFS：从患者开始免疫治疗的日期到任何原因的进展或死亡进行评估

• OS：在发现队列和验证队列中，从ICI治疗开始之日起计算OS，在最后一次接触之日对未死亡的患者进行检查。（Note：在来自Samstein等人的未经ICI治疗的队列中，OS是从首次输注化疗之日起计算的，而在TCGA队列中，OS是从首次诊断之日算起的）

2.4 肿瘤免疫原性和抗肿瘤免疫力分析

为了研究TET1-MUT肿瘤的肿瘤免疫微环境，作者在TCGA数据集中进一步比较了TMB，新抗原负荷，肿瘤浸润性白细胞，TET1- MUT和TET1- WT肿瘤之间的免疫特征和免疫相关基因的表达。

• TMB采用为未经归一化的体细胞非同义突变计数的总数

• 新抗原负荷定义为相关数据里确定的预测的新抗原总数。

• R包MCP计数器用于估计肿瘤浸润白细胞的丰度。

• 使用R包GSVA来确定每个免疫特征的单个样本基因集富集（ssGSEA）得分。

• 免疫相关基因及其表达水平被量化为FPKM（每百万个映射片段的外显子模型的每千碱基碱基的片段数）并进行log2转化。

2.5 统计分析

• 用Fisher精确检验来评估具有应答的特定突变基因的富集程度（CR / PR与PD / SD），并控制P值的错误发现率（FDR）。

• 使用Fisher精确检验检查TET1状态与ORR或DCB 之间的关联。

• TET1-MUT和TET1-WET的无进展生存率和总生存率患者通过Kaplan-Meier方法，对数秩检验和Cox比例风险回归分析进行分析，并针对可用的混杂因素进行了调整，包括：1）发现队列中的年龄，性别，癌症类型和TMB；2）验证队列中的年龄，性别，癌症类型，TMB状态和MSI状态；3）在未经ICI治疗的Samstein等人的队列中，性别，癌症类型，TMB状况；4）年龄，性别，种族，癌症类型，组织学等级，肿瘤分期，TMB和TCGA队列中首次诊断的年份。

• 评估了TET1状况与以下因素之间的相互作用，包括年龄（≤60岁与≥60岁），性别（男性与女性），癌症类型（黑色素瘤，膀胱癌，NSCLC与其他癌症），TMB状况（低与高 ）和药物类别（单一疗法与联合疗法）。

• 使用Mann-Whitney U检验检查了TET1- MUT和TET1- WT肿瘤之间的TMB，新抗原负荷，肿瘤浸润性白细胞，免疫标记或免疫相关基因表达的差异。显着性设定为0.05，所有统计检验均是双面的。

3.结果：

3.1TET1基因突变与ICI治疗的临床反应有关

首先，作者在发现队列进行反应相关突变的的分析，Table1为发现队列的临床特征，从下面Fig2a可以看出TET1-MUT在CR/PR富集，预示着TET1突变可能是ICI治疗的潜在预测生物标志物。然后作者收集cBioPortal网站相关的基因组数据来进一步验证TET1在多种癌症类型的突变频率（150项研究, 32568例, 39种癌症类型），Fig2b图棒棒图部分说明：TET1的体细胞突变均匀分布，没有任何带注释的功能性热点突变。柱状图部分则进一步显示在不同癌症中突变的比率。皮肤，肺，胃肠道和泌尿生殖系统是突变率最高。 以上结果说明，TET1突变在各种类型肿瘤中普遍存在，且与ICI治疗临床反应存在联系。

Table1:发现队列数据的临床特征：

Fig2：
a图为：来自于发现队列的数据，临床反应相关的突变CR/PR vs PD/SD (两尾Fisher精确检验，CR / PR患者 为n = 126例，PD / SD患者为n = 389例). 灰色虚线表示调整后的错误发现率P = 0.05（Fisher的精确检验）。b图为：cBioPortal网站相关的基因组数据。对于每种癌症类型，其突变频率高于1％的TET1-MUT肿瘤比例。条形图上方的数字表示改变的频率，接近癌症名称的数字表示TET1-MUT患者的数量和患者总数。“CNStumor”表示中枢神经系统肿瘤。“Truncating mutations”包括无意，不间断，剪接位点突变以及移码插入和删除；“non-truncating mutations”包括错义突变以及框内插入和删除。

3.2 TET1-MUT对ICI治疗的预测功能（发现队列）

为了进一步研究TET1突变与ICI治疗临床反应存在在具体联系，作者在发现队列中进一步评估了相对应的临床结果。从Fig3a、b中，我们可以看出TET1突变的患者较TET1野生型患者有更好的ORR和DCB，Fig3c、d中可以看出TET1突变的患者教TET1野生型患者有更好的PFS（危险比（HR）= 0.46 [95％CI，0.25-0.82] ，P=0.008)、OS（ HR = 0.54 [95％CI，0.27至1.11]，P  = 0.095）。以上结果说明，TET1突变在ICI治疗的患者中显示出更好的临床反应和预后。

Fig3:数据皆来自发现队列：
a图：直方图描绘了在TET1- MUT和TET1- WT组中达到客观反应（ORR）的患者比例。（n  = 515；4名总体反应最佳的患者无法评估）b图：直方图描绘了在TET1- MUT和TET1- WT组中获得持续临床获益（DCB）的患者比例。（n  = 495；24例具有持久临床获益的患者无法评估）c图：Kaplan-Meier评估发现队列中患者的无进展生存期（PFS）。（n  = 519）d图：Kaplan-Meier在发现队列中比较了TET1- MUT 患者和相应的WT对应患者的总生存期（OS）。（n  = 490；29位患者无可用的OS信息）

3.3 TET1-MUT预测功能的验证（验证队列）

为进一步了解TET1的预测功能，作者在验证队列中进一步验证。首先，在验证队列的经过ICI治疗的队列里比较TET1-MUT和TET1-WT在OS上的差异，Fig4a说明：TET1在ICI治疗的肿瘤患者中，突变型比野生型有着更长的OS（调整混杂因素后，HR:0.47，95%CI:0.25-0.88，P=0.019）在该ICI治疗的验证队列中，患者已知状态MSI的共有1172名，如Fig4b所示：其中47人MSI-H，而40是TET1-MUT，只有7例均为MSI-H和TET1-MUT。

因此，作者进一步分析了涉及到MSI状态后TET1对预后的影响，如Fig4c示：在患者低微卫星不稳定性（MSI-L）或微卫星稳定（MSS）时，TET1-MUT患者的OS仍然显著长于TET1-WT型，且和MSI-H的患者生存相似。这表明TET1 -MUT可能可与MSI-H一起作为预后标志物。

同时在年龄，性别，癌症类型，TMB状态和药物类别的亚组中，如Fig5所示：TET1- MUT相对于TET1- WT 的有利临床结果也很突出且一致。

最后，作者在验证队列未接受ICI治疗的队列里进一步TET1突变与野生型的生存差异，如Fig4d所示：在未经ICI治疗的队列里，TET1-WUT与TET1-WT在OS上无差异。

以上结果进一步证明，TET1可以作为ICI治疗的肿瘤患者的预后标志物。

Fig 4：数据来自验证队列

a图：Kaplan-Meier曲线比较了验证队列中TET1- MUT 患者和TET1- WT患者的总生存期（OS）b图：Venn图显示在验证队列的已知MSI状态的患者中同时存在MSI-H和TET1-MUTc图：Kaplan-Meier曲线比较了验证队列中MSI-H，MSI-L / MSS和TET1 - MUT中的 OS，以及MSI-L / MSS和TET1- WT组中的OSd图：Kaplan-Meier曲线研究了TET1-MUT在非ICI治疗的队列中对Samstein等人的预后影响

Fig5：森林图：年龄，性别，癌症类型，TMB状态和药物类别的亚组

3.4 TET1-MUT与增强的免疫原性和激活的抗肿瘤免疫力有关

为了表征TET1-MUT肿瘤的肿瘤免疫微环境，作者分别在Samstein的验证队列和TCGA数据里比较了TET1-MUT和TET1-WT肿瘤之间的肿瘤免疫原性和抗肿瘤免疫性。如Fig6a示：左边来自于Samstein的队列，右边来自于TCGA队列，显示TET1-MUT肿瘤的TMB水平均显着高于TET1-WT肿瘤；同时，如Fig6b所示：TET1-MUT肿瘤中的新抗原负荷也显着更高（来自TCGA数据），表明TET1-MUT与增强的肿瘤免疫原性有关。

更深层的，作者进一步分析了免疫浸润细胞的区别，如Fig6C示：肿瘤浸润性T淋巴细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞在TET1-MUT较-WT更丰富.

此外，作者进一步行免疫特征分析，如Fig6d所示：TET1-MUT肿瘤中的溶细胞活性信号也显着更高，同时调节信号也普遍上调，包括抗原提呈细胞和T细胞的共抑制和共刺激因子 。作者还彻底检查了TET1-MUT和TET1-WT肿瘤之间的免疫相关基因表达模式的差异，如Fig6e所示：与免疫浸润和标记相一致，TET1-MUT肿瘤中的许多刺激性免疫调节剂通常被上调，例如趋化因子（CXCL9，CXCL10，CCL5）和细胞溶解活性相关基因（PRF1，GZMA）；免疫检查点，例如CTLA4，LAG3和在TET1- MUT肿瘤中，针对TIT1- WT肿瘤的TIGIT也被上调。

以上结果说明:TET1- MUT与增强的肿瘤免疫原性和相对较热的免疫微环境密切相关。

Fig6：数据来自TCGA数据、Samstein的队列验证队列

a图：左边来自于Samstein的队列，右边来自于TCGA队列，在TET1-MUT与TET1-WT之间TMB的比较b图：TCGA队列，TET1- MUT和TET1- WT之间新抗原负荷的比较c图：TCGA队列，在多种癌症类型中，与TET1-WT与TET1-MUT之间平均肿瘤浸润白细胞MCP计数器得分的log2转换倍数变化。d图：TCGA队列，TET1-MUT肿瘤与TET1-WT肿瘤的平均免疫特征ssGSEA得分的log2转换倍数变化e图：热图描绘了不同癌症类型的TET1-MUT和TET1-WT肿瘤之间免疫相关基因mRNA表达的平均差异。热图的x轴表示不同的癌症类型，y轴表示肿瘤浸润的白细胞，免疫标记或基因名称。每个方块代表每种癌症类型中TET1-MUT和TET1-WT肿瘤之间每个指示的肿瘤浸润性白细胞，免疫标记或免疫相关基因的倍数变化或差异。红色表示上调，而蓝色表示下调

4.流程图和结论：