易基因｜DNA甲基化和单细胞RNA-seq联合揭示空气污染对复发性流产的表观遗传影响
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2022年08月23日，《Clin Epigenetics 》杂志发表了题为“Integrated single-cell RNA-seq and DNA methylation reveal the effects of air pollution in patients with recurrent spontaneous abortion”的研究文章，该研究通过常规 RNA 测序 (RNA-seq)、简化基因组重亚硫酸盐测序 (RRBS) 和单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)对人工流产患者和复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）患者的蜕膜组织进行深度分析，从表观遗传学角度揭示了RSA全面的细胞和分子机制，表明空气污染可能通过影响IGF2BP1启动子甲基化水平而导致妊娠失败。
标题：Integrated single-cell RNA-seq and DNA methylation reveal the effects of air pollution in patients with recurrent spontaneous abortion（单细胞RNA-seq和DNA甲基化综合分析揭示空气污染对复发性流产患者的影响）
发表期刊：Clinical Epigenetics
发表日期：2022年08月23日
影响因子：7.259/2区
方法：常规RNA-seq、简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）、单细胞RNA-seq
样品：纳入31名不明原因的RSA患者和46名对照组共77名受试者，随机选择三名RSA患者和三名匹配对照组的蜕膜组织DNA和RNA进行RRBS测序和RNA-seq分析。
研究摘要：
背景：
母体空气污染物暴露与许多不良妊娠结局有关，包括复发性自然流产（RSA），然而其潜在机制仍未知。本研究旨在了解RSA机制及其与空气污染暴露的关系。通过常量RNA测序（RNA-seq）、简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）综合分析了人工流产患者和RSA患者蜕膜组织的DNA甲基化数据和转录组数据。并使用RT-qPCR和焦磷酸测序验证差异表达基因（DEG），采用logistic回归模型分析空气污染物暴露与RSA之间的关联。
结果：
本研究通过将RRBS和RNA-seq数据联合分析，共鉴定98个异常甲基化DEG，鉴定出19个免疫细胞亚群。与正常对照组相比，RSA患者蜕膜组织中的NK细胞和巨噬细胞比例不同；RSA患者和对照组之间的IGF2BP1甲基化和基因表达不同；妊娠前一年和妊娠早期阶段母体空气污染物暴露与RSA风险之间存在显著的正相关。中介分析 (Mediation analysis)表明，24.5%的空气污染由IGF2BP1甲基化介导对RSA风险产生影响。
结论：
本研究揭示了RSA的综合细胞和分子机制，并表明空气污染可能通过影响IGF2BP1启动子甲基化水平而导致妊娠失败。
研究思路：
结果图形
（1）RSA组和对照组中蜕膜组织的全基因组DNA甲基化分析
图1：蜕膜组织差异DNA甲基化水平。
- 蜕膜样本中差异基因圆形图。最中心两个圆圈表示差异高甲基化和低甲基化频率。
- RSA组和对照组蜕膜组织中每个基因甲基化水平P值曼哈顿图。水平线是提示性DNA甲基化序列显著性阈值截止点。
- DMG富集分析。
- DEG火山图。
- TOP 40 个DEG基因热图（20个上调和20个下调）。
- DEG富集分析
（2）RSA患者蜕膜组织中鉴定的DEG单细胞表达谱
图2：RSA患者蜕膜细胞图谱。
A-B. RSA患者和对应健康对照组所有细胞的UMAP投影，不同颜色表示细胞簇。
C. 两组对每个细胞簇的贡献箱型图。
D. 已知细胞标记的表达点图。
（3）DMR与全基因组基因表达的相关性和验证
图3：基因表达谱和DNA甲基化的综合分析和验证分析。
- DMR和对应DEG表达四象限图。黄色表示高甲基化基因下调DEG，绿色表示低甲基化基因上调DEG。
- 筛选6个基因的相对表达水平点图，*P<0.05，**P<0.01。
- IGF2BP1基因的焦磷酸测序结果。
- FLT1基因的焦磷酸测序结果。
（4）空气污染与RSA之间的关系
表1：孕期或孕前不同阶段与六种空气污染物接触之间的关系
图4：空气污染与RSA的关系。
- 不同季节的空气污染物与RSA的关系。
- 从妊娠前1年至孕早期，RSA与不同空气污染物暴露关联的相对风险及其95%CI。
（5）空气污染物可能通过影响DNA甲基化从而导致复发性流产
图5：与空气污染相关的IGF2BP1启动子DNA甲基化。
- IGF2BP1中6个DMC位点与空气污染之间的关联热图。
- 潜变量(latent variable)（内模型，inner model）与显变量（manifest variables）（外模型，outer model）关系的概念模型路径图。
- 空气污染如何促进IGF2BP1启动子区域甲基化水平变化图解。
表2：母体空气污染暴露与蜕膜组织IGF2BP1甲基化的线性回归分析
研究结论：
本研究揭示了与RSA发病机制相关的异常基因表达、表观遗传修饰和免疫图谱。PM2.5、PM10、NO2、SO2和CO等空气污染物增加与RSA风险呈正相关，尤其是在寒冷季节。作者鉴定并验证了IGF2BP1在RSA蜕膜组织中显著上调，7个CpG位点的甲基化水平显著降低，其中5个CpG位点与空气污染密切相关。本研究可能为IGF2BP1甲基化在RSA与空气污染物关联的24.5%中介效应提供支持性证据，为RSA研究提供了新方向。
易基因简化基因组甲基化测序研究解决方案
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
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技术优势：
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- 针对性强，成本较低；
- 基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。
应用方向：
RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：
- 队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
- 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
- 模式动物发育和疾病甲基化研究
| 技术参数 | RRBS | DRRBS | cfDNA-RBS | Micro-RBS | sc-RBS |
|---|---|---|---|---|---|
| 原理 | MspI酶切+连接接头 | 多酶切+连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 |
| 样本要求 | 1μg | 1μg | 1ng | 1ng | 单细胞/1-10个细胞 |
| 测序数据量 | 10G | 15G | 20G | 20G | 2G |
| 5XCG位点覆盖 | 6M | 8M | 6M | 10M | 4-8M |
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参考文献：Zhu W, et al. Integrated single-cell RNA-seq and DNA methylation reveal the effects of air pollution in patients with recurrent spontaneous abortion. Clin Epigenetics. 2022 Aug 23;14(1):105.
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