文献标题：DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors
发表时间：April 03, 2019
发表杂志：Cell Systems（IF=8.673）
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.003
摘要
单细胞RNA测序数据通常容易受doublets引入的技术误差影响，这一现象限制了单细胞技术种的细胞通量，并且可能导致欺骗性的下游分析结果。作者开发了DoubletFinder，利用基因表达数据鉴定doublets。DoubletFinder通过随机选取细胞对组成人造doublets，根据每个真实细胞在基因表达空间中与人造doublets的接近程度来预测doublets。作者首先利用已知doublets信息的单细胞数据来展示DoubletFinder如何鉴定由转录特征不同的细胞形成的doublets，在移除这些doublets后，差异表达分析得到了改善。其次，作者提供了一种方法估计DoubletFinder的输入参数，使其可以用于具有不同异质性特点的scRNA-seq数据。最后，作者展示了DoubletFinder的”最佳实践“，并提示DoubletFinder对具有”杂交“（hybrid）转录特征的细胞类型不敏感。
引言
在高通量单细胞RNA测序实验中，由于细胞是被随机分配到液滴或纳米孔中，根据Poisson统计分布，单个液滴包含超过一个细胞（doublets或multiplets）的频率随着上机细胞的浓度而改变。通常，如果上样细胞浓度较高，发生doublets的频率也会增加。因此，单细胞实验中的doublets事件限制了实验时的细胞通量。
目前有一些样本复用（multiplexing）技术被开发出来，通常是利用不同样本的barcode或遗传学信息（如SNP）以区分来自不同样本的细胞，以及因上样细胞过浓而形成的doublets。然而，它们无法区分来自相同样本的doublets。
DoubletFinder原理和流程
DoubletFinder流程可以分成两个部分：
参数选择
- 对原始表达矩阵做基本质控（根据UMI数、线粒体基因比例等过滤低质量细胞），并完成Seurat一般流程；
- 随机选择细胞对，对原始UMI值取平均，合成人造doublets，并与原数据合并，使得合成doublets占所有细胞的比例为pN。默认最大pN为25%，目的是生成足够多的人工doublets；
- 按照原数据的参数，对合并数据重新运行Seurat流程到主成分分析（PCA）这一步。需要注意的是，在合并数据中，不对nUMI进行线性回归削弱，目的是保留doublets和singlets的差异；
- 将合并数据的细胞在主成分空间的嵌入信息转换成欧几里得距离矩阵，基于该距离矩阵定义每个细胞的最近近邻（nearest neighbors，NN）；
- 用pK表示领域大小（neighborhood size，例如对5,000细胞的数据，pK=0.01时，相当于寻找给定细胞近邻的200个细胞）。将人造NN（artificial nearest neighbors，ANN）数除以领域大小，得到人造NN的比例（pANN）；
- 对不同的pN-pK组合分别计算pANN。利用 BCmvn 最大化的方法选择最优pK，而将pN固定为25%，并利用该组合下的pANN鉴别doublets；
鉴定doublets
- 根据期望doublet rate，估计总doublets数的期望值；
- （可选）根据Poisson doublet形成率估计异型来源的（heterotypic）doublets期望值。这里涉及一个同型来源（homotypic）doublets的校正步骤，同型doublets的比例（pHomo）等于每个细胞类型频率的平方和。将1-pHomo作为异型doublets的频率pHeter，计算异型doublets的期望数量；
- 根据doublets的期望数设置pANN的阈值，鉴定并去除doublets。
关于BCmvn
在数据分布中，BC（bimodality coefficient）用来衡量与单峰分布的偏离程度。在DoubletFinder里，作者假设最优的pK-pN组合应该使得pANN呈非单峰分布，也就是说doublet（pANN偏大）和singlet（pANN偏小）能够截然分成两个峰。对于每个pK-pN组合都可以根据pANN的分布计算BC值。对给定pK值下的所有pN（例如从5%到25%），计算BC值的均值 ，以及方差 ，二者相除得到 BCmvn 值，选取最大值所代表的pK作为最优pK。
结果
作者以Demuxlet和cell hashing的数据作为已知doublet信息（即Ground-truth）的参考，评估DoubletFinder的表现。
首先作者评估了pN和pK对分类准确性的影响，结果发现单纯改变pN参数几乎不影响分类效果，因此默认设置为25%，为的是生成足够多的人工doublets。相反，pK过小或过大都会使分类准确性下降。我的理解是，如果doublets本身的表达谱差异较大，pK过小时，相当于只能找到和人工doublets相似度较高的doublets，假阴性率会增加；而pK过大到一定程度时，每个细胞的pANN就被稀释了。因此pK需要根据不同数据集进行优化（图1C）。
作者接下来还测试了DoubletFinder和nUMI的分类效果，发现DoubletFinder显著优于nUMI，并且即使二者联合后也几乎和单独使用DoubletFinder没有差别（图1D）。
Ground-truth数据包含样本内和样本间doublets，而Demuxlet鉴定的是样本间doublets，因此作者需要结合期望的doublet rate增加样本内doublets的估计数量。最后的结果显示DoubletFinder在Demuxlet的基础上发现了某些来自样本内、不同细胞类型组成的doublets，但似乎对同型doublets的鉴定效果不佳（图1E、F）。
最后，作者比较了doublet去除前后对差异表达分析的影响，意料之中地，去除doublet后各个细胞类型能鉴定出额外的差异基因。
作者同样测试了细胞聚类数和聚类区分度对DoubletFinder的影响（图2A、B）。当数据中细胞类型较少时，pK对结果的影响不大，而随着细胞类型的增多，过大的pK反而降低分类的准确性，因此更加强调了参数优化的重要性。而当数据的异质性不大（例如pDE为0.5%）时，无论pK如何改变，其分类效果都不是很好，这也再次强调了DoubletFinder不适用于异质性较低的数据集，例如经过分选纯化的单一细胞类型样本。
最后，作者使用真实数据测试了DoubletFinder对下游差异表达分析的改善情况。这套数据中包含一类经过实验验证的新细胞类型（CDTC），它同时表达CDIC和CDPC的marker基因，DoubletFinder准确地讲64%的CDTC鉴定为singlets。在校正了同型doublets比例后，97%的CDTC都被鉴定为singlets。
讨论
总的来说，DoubletFinder适用于鉴定来自不同样本或不同细胞类型的doublets，因为这些doublets具有与singlets明显不同的转录组特征。对于同型doublets，DoubletFinder的表现较差。作者认为，与Demuxlet或Cell Hashing联合使用能帮助鉴定出来自不同样本的同型doublets，一定程度上弥补DoubletFinder的缺陷。但我个人认为，用到这两个技术的单细胞文献确实也不多，作者的想法可能最多也就稍微解决一下上样浓度过大的问题，通俗的说就是挤牙膏般地省一些科研经费……
和Scrublet文章的观点类似，同型doublets本身难以通过NN的方式对下游分析的影响一般比异型doublets小得多，为了防止doublet效应的过度校正（假阳性率过高），两种方法都倾向于保留这部分细胞。DoubletFinder给出了估计同型doublets比例的选项，并提出预先对细胞类型做注释可能有助于更准确地估计同型doublets。总之，感觉就是你需要在下游分析出问题的时候时不时回顾前期的质控。