LZTR1 is a regulator of RAS ubiquitination and signaling

1. 背景

1.1

选择本文，是因为RAS作为第一个被克隆出来的原癌基因，其作用至关重要，它的激活状态与许多肿瘤都密切相关，却又难以靶向（undruggable）。时隔多年，终于有人鉴定出RAS的第一个E3 ligase：LZTR1

1.2

在PROTAC技术日益成熟的今天，将LZTR1与RAS连接起来致其降解已经不再是难题了。

PROTAC

时至今日，也许这便是除靶向KRAS p.G12C之外唯一有效的RAS抑制剂筛选方案。

1.3 RAS

RAS在多种肿瘤存在广泛突变

RAS难以靶向

目前抑制RAS的策略：

RAS信号通路抑制剂：

RAS膜转运抑制剂：

1.4 LZTR1

1.5 gene trap

2. 研究结果

2.1

• 作者对感染了gene-trap的KBM-7细胞进行大规模的培养后，使用了6个BCR-ABL抑制剂，分别对其做了多次药物筛选。
• 经过连续14-21天药物处理，对给药前、给药后的细胞深度测序，最终筛选出十几个敲除后高度耐药的基因。

2.2

• 作为Science文章，该有的严谨是不会缺席的，因此筛药之后作者对以上6个基因分别单独敲除验证其耐药的阳性率。
• 这里用到了MCA多色流式竞争实验，是常用的一种实验方法，以明确敲除后细胞增殖速率的增减。
• 结果再次确认，对以上六个基因分别使用2条（及以上）sgRNA进行敲除后，随着imatinib剂量提高，耐药的效果更佳明确。
• 因为NF1 WT1 PTPN1 PTPN12 BAP1等均可依据已有发现大体推导耐药机制，惟有LZTR1这个kelch protein耐药机制不明，作者于是将研究重点转向了LZTR1。

2.3

• 虽然在KBM-7细胞上已经得到了确切的结论，即以上6个基因对BCR-ABL抑制剂的耐药有关键作用，那么是否可以进一步推广至其他不同遗传背景的细胞呢？
• 于是作者继续在KCL-22 K-562 MV4-11等多株细胞（CML、AML）进行了敲除验证。结果显示，LZTR1介导的耐药效果拔群！而耐药与RAS下游MAPK通路的激活密切相关。

2.4

• 果蝇是展示发育异常较好的模式动物，其复眼及翅膀上静脉的异常增生可以很好地反映RAS信号是否异常激活。
• 作者在果蝇敲除了LZTR1的同源基因CG3711，可以看到静脉的增生、小眼发育的异常。
• 作为对照，作者同时做了RAS组成性激活的几个突变，均可得出类似的结论。

2.5

• BioID是常用的相互作用蛋白研究工具。
• 其基本原理为将BirA进行R118G的点突变，使其丧失生物素化的选择性，可以令与之fusion蛋白空间上邻近的所有蛋白生物素化。借助streptavidin-biotin的结合即可pull-down相互作用蛋白。

• 本研究中，作者利用bioID分别捕获了4种RAS的相互作用蛋白。

  
  
  
  
• 结果显示，LZTR1与4个ras均有较强的相互作用。
• 接下来逐一加以验证，可以清楚地看到，无论是直接IP还是通过BioID pull-down, RAS均可与LZTR1结合。

2.6

• 实际上，作者并不满足于LZTR1与RAS的相互作用。他的野心在于验证LZTR1是否是一个良好的、特异的靶向ras的靶点。

  
  

• 为此，作者分别验证了RAS超家族成员、RAS信号通路的下游分子等几乎所有蛋白是否与LZTR1结合。结果是喜人的：lztr1仅与RAS结合，不与任何相关分子结合。

• 这便为PROTAC技术提供了潜在的可能。（这是后话，但是我忍不住想剧透了）

2.7

• 因为LZTR1具有BTB domain，是一个kelch protein，这一类蛋白往往与Cul3蛋白有互作。作者便考虑LZTR1是否可能是Cul3的一个adapter。

• 从定位的角度，可以看到lztr1与CUL3是共定位的。并且内源性KRAS是有泛素化的。

  
  

• 紧接着，作者验证了LZTR1可以介导外源性ras的泛素化。

  
  

• 进一步，LZTR1可以介导内源性RAS泛素化。

• 这里TUBE2技术的原理是结合所有泛素化domain，将之pull-down。

  
  

2.8

• 做到这里，实际上已经基本阐明了LZTR1的基本作用：介导CUL3泛素化RAS，调控下游mek erk等信号，最终达到影响BCR-ABL TKI的目的。
• 但作者在之前敲除LZTR1的细胞上，进一步双敲除了内源性RAS，已验证耐药是否是RAS调变的结果。

• 可以看到，双敲除了四个RAS后，对耐药的影响各有不同。KRAS逆向rescue效果最佳。

  
  

2.9

前面做的这么多结果，是否有其现实意义呢？
毕竟，LZTR1在CML AML的突变并不多，而是相对集中在NS, GBM, SWNMT等一类遗传性疾病上。

• 于是作者将以上疾病的高频突变转入K-562。模拟研究其突变是失活还是激活。

• 可以看到，大多数突变发生后都可以导致耐药。

  
  

• 无论是MCA实验还是信号通路，都能得到一致的结果。

  
  

• 此外，这些失活突变也令LZTR1的定位有了不同程度的改变。

  
  

3. 总结

• LZTR1作为CUL3的adapter，可以介导RAS多泛素化。
• 在GBM NS SWNMT等疾病中，LZTR1发生高频失活突变，导致功能缺失，RAS泛素化减少，下游信号激活。对TKI耐药。
• 现实意义：结合PROTAC技术，将LZTR1与linker连接起来，即可靶向RAS促其泛素化。

（感谢观看！）
2020.5.26 忍冬