近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿最热门的研究方向之一，不断有CNS的文章问世，国自然资助的项目数量也逐年上升。
m6A是什么，m6A调控因子、m6A检测方法有哪些，m6A在人类疾病中扮演哪些作用。本文将做一简明阐述。
m6A概念
N6-methyladenosine也叫m6A，是一种广泛存在于mRNA上的碱基修饰行为，mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。
mRNA最常见的内部修饰包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。N6-甲基腺嘌呤(m6A)在 mRNA 内部修饰碱基中所占比例最大，主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。
早在20世纪70年代，Desrosiers. R等在人哺乳动物细胞的 mRNA 中发现了m6A的存在，但m6A的功能以及作用机制却一直鲜有研究。
直到 2011 年，芝加哥大学何川教授团队在 *Nat Chem Biol *发表文章“N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”，揭示m6A的可逆化修饰，使 m6A 的研究重新热门起来。
m6A的分子改变是什么？
从图2中我们可以看到，这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸，确切地说叫N6-methyladenosine。
一共分为2个大的结构，左下角的是五碳糖，图2中a框部分也就是五碳糖的第二位C处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸（从RNA变成DNA）。图2中c框部分标注的，也就是第四位的C处通常会带有磷酸基。图2中b框部分通常就是我们所说的含氮碱基。
这里特指腺苷酸（A），当腺苷酸的第六位N处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。
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m6A调控因子
m6A这种甲基化修饰是可逆化的，调控因子包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。
甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。
而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。
甲基化转移酶（methyltransferase）也称为Writers，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白会形成复合物（complex），共同行使催化功能。
m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。
2011年，芝加哥大学何川教授团队首次证实， FTO蛋白是一种重要的去甲基化酶。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。
发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能，需要甲基化阅读蛋白，也称为reader。阅读蛋白主要包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域，削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。
m6A检测方法
目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），常用的方法主要包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS以及比色法。其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平，而MeRIP-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。
LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，获得分子离子峰和碎片离子峰，对碱基同时进行定性和定量分析。
LC-MS/MS法第一步使用TRIzol提取完总 RNA后，可以用oligodT磁珠或者rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA。
第二步使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA消化成单个碱基。
第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色谱仪，计算各个碱基的含量。
第四步进入质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤。最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。
LC-MS/MS为最早检测m6A的方法，操作较为繁琐。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。
2012年之前，全基因组或全转录组水平上鉴定m6A修饰的研究领域是一片空白。
2012年Meyer K. D发表于Cell上的论文“Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons”和Dominissini D发表于Nature上的论文“Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq”第一次从转录水平上，大范围、高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平。
这种方法被称为MeRIP-seq或m6A-seq。
MeRIP-seq操作第一步先对mRNA进行片段化，接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集，然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到m6A甲基化程度较高的区域（m6A peak）。
这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析。但是MeRIP-seq只能鉴定m6A高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。
2015年，Bastian Linder等发表在Nature Methods的文章“Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome”，第一次从单碱基的水平测定m6A。
这种技术被称为miCLIP-seq。
miCLIP-seq操作第一步对富集完的mRNA进行片段化。
第二步，使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的mRNA片段进行结合。
第三步，使用紫外交联进行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端连上接头序列，在5’端加上P32放射性标记后进行移膜。
第四步，根据放射性标记进行切膜回收后，对mRNA片段进行反转录和纯化回收。
第五步，对反转录组的cDNA进行环化。
第六步，对环化的cDNA进行复线性化，然后构建测序文库上机测序。
m6A在疾病中的研究热点（2020年）
1. 肿瘤
2020年3月发表于Cancer Cell上的综述性文章“m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer”，文章指出，m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化不尽相同，环境改变和位点突变均可导致m6A状态的改变，同时m6A参与一些肿瘤靶向治疗基因的调控。
2. 病毒感染
2020年2月发表于Nature Microbiology上的文章“N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I”，文章指出，人类偏肺病毒（HMPV）在其RNA中获得m6A，可以模仿正常细胞的RNA，躲避免疫系统的检测。
3. 神经脱髓鞘改变
2020年1月发表于Neuron上的文章“m6A mRNA Methylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination”，文章指出，m6A去甲基化酶METTL14的减少会导致少突胶质细胞的减少及中枢神经的脱髓鞘改变，提示m6A在神经细胞的发育中起着重要的调节作用。
m6A的研究热点不断升级，今后会有更多的高分文章出现，关联的疾病也会越来越多。
但是，m6A的检测方法较为繁琐，所需费用也比较高，限制的m6A的研究进展以及临床应用，发展快速简便经济的检测方法是今后m6A检测技术的发展方向。
同时在研究层面，m6A作为十分重要的 RNA 表观遗传学修饰，如何与 DNA、组蛋白表观遗传学协同作用调控基因表达，也需要进一步深入探索。
参考文献
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