细胞技术讨论——RAW264.7的基因敲除心得

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究中应用广泛，由于RAW264.7能够进行胞饮和吞噬作用，所以被广大科研者认为是巨噬细胞的最佳模型之一。

对于如何解决RAW264.7细胞的基因敲除，也是海星生物-cas9x.com的一个重要的研发方向，历时一年多的研发，我们终于在技术层面解决了这个RAW264.7细胞株的基因编辑的难题，可以为客户提供编辑效率高、结果稳定、周期快速的细胞基因敲除的解决方案。

RAW264.7细胞基因敲除/基因敲入/基因突变的技术流程如下：

一、 RAW264.7细胞的培养条件及其注意事项

RAW264.7细胞使用的培养条件为：DMEM高糖+10%FBS。RAW264.7细胞对血清质量要求比较高，建议使用高质量胎牛血清。

RAW264.7细胞具有两种状态：

1、 未活化的RAW264.7细胞：通常形态呈圆形，贴壁黏附能力较弱；

2、 活化的RAW264.7细胞：一旦受到刺激活化RAW264.7细胞会长出伪足，黏附能力增强，同时细胞表面活化的Marker也会增加表达。

所以在RAW264.7细胞的培养过程中，要及时换液和传代，否则，饥饿的细胞状态会急剧恶化，出现大量伪足，且不可逆转，最后，细胞生长速度会变得十分缓慢。

【ATCC官网RAW264.7细胞培养照片】

由于我们对RAW264.7细胞传代和换液的频率控制的比较好，大幅的改善了RAW264.7细胞的状态。下图是RAW264.7的细胞状态图片。

【RAW264.7细胞培养照片】

二、 RAW264.7细胞的转染条件优化

海星生物-cas9x.com会根据每个细胞的特性优化其电转条件，其中就包括电转缓冲液的优化，我们尝试在电转缓冲液中加入了吸附剂，可以大大促进DNA吸附到细胞的表面，同时还加大的缓冲液的电阻，从而可以提供电转的电压，大幅度的提升了电转的效率，是传统缓冲系统的3-5倍的效率，达到80%。同时由于提高了细胞的存活率到90%，所以细胞的基因编辑的效率也得到了大幅度提升。

【GFP表达载体电转后72小时对比图片】

3、RAW264.7细胞的快速克隆化条件优化；

由于使用了ClonePlus技术，RAW264.7的细胞克隆形成能够达到95%以上，而且克隆形成的时间也缩短到1-2周的时间，大大压缩了整个克隆检测的时间周期。（而传统的克隆过程需要1个月）

VIRUS-Free技术，与病毒法相比，效率更高，周期更短，而且可以规避病毒重新复制的风险。悬浮细胞与贴壁细胞相比，其药物抗性筛选难度大，单克隆化效率低，再加上基因定点突变效率远低于基因敲除效率，两种因素叠加导致拿到的突变纯合子的概率极低。

ClonePlus技术, 采用专有的胶体表面处理，RAW264.7细胞株的克隆率超过95%，可以轻松进行克隆分离和克隆PCR鉴定，大幅度的提高了细胞的鉴定阳性率。